Методическая статья

Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

59.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2763

⸱

26 марта 2011 г.

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Oncology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Это видео демонстрирует протокол для выделения ДНК из фиксированных формалином парафин материала. Это многодневных процедура, при которой ткань разделы deparaffinized с ксилол, регидратации с этанолом и обрабатывают протеиназы К, чтобы очистить и изолировать ДНК для последующего гена или конкретной генома анализа.

Аннотация

Развитие и прогрессирование заболеваний характеризуются частыми генетическими и эпигенетическими аберрациями, включая хромосомные перестройки, увеличение и потерю числа копий, а также метилирование ДНК. Достижения в технологиях высокопроизводительного общегеномного профилирования, таких как микрочипы, значительно расширили наши возможности по идентификации и обнаружению этих специфических изменений. Однако по мере совершенствования технологий ограничивающим фактором остаются качество и доступность образцов. Кроме того, последующая клиническая информация и данные об исходе заболевания часто собираются спустя годы после первоначального забора биоматериала. Образцы, обычно фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE), хранятся в больничных архивах от нескольких лет до десятилетий. ДНК может быть эффективно и качественно выделена из парафинизированных образцов при применении соответствующего метода экстракции. Высококачественная ДНК, экстрагированная из правильно законсервированных и хранимых образцов, может быть использована в количественных анализах для сравнения нормальных и пораженных тканей, а также для создания генетических и эпигенетических сигнатур 1. Для выделения ДНК из парафинизированных образцов тканевые керны или микродиссекированная ткань подвергаются обработке ксилолом, который растворяет парафин в ткани, а затем регидратируются с помощью серии промывок этанолом. Белки и вредные ферменты, такие как нуклеазы, впоследствии перевариваются протеиназой K. Добавление лизирующего буфера, содержащего денатурирующие агенты, такие как додецилсульфат натрия (SDS), облегчает процесс переваривания 2. Нуклеиновые кислоты очищают из лизата ткани с использованием насыщенного буфером фенола и высокоскоростного центрифугирования, в результате чего образуется двухфазный раствор. ДНК и РНК остаются в верхнем водном слое, в то время как белки, липиды и полисахариды отделяются в интерфазе и органической фазе соответственно. Сбор водной фазы и повторные экстракции фенолом позволяют получить чистый образец. После экстракций фенолом добавляют РНказу A для удаления contaminating РНК. Дополнительные экстракции фенолом после инкубации с РНказой A используются для удаления остатков фермента. Добавление ацетата натрия и изопропанола осаждает ДНК, а высокоскоростное центрифугирование используется для осаждения ДНК в гранулу и облегчения удаления изопропанола. Избыток солей, перенесенных при осаждении, может мешать последующим ферментативным анализам, но их можно удалить из ДНК путем промывки 70% этанолом с последующим центрифугированием для повторного осаждения ДНК 3. ДНК ресуспендируют в дистиллированной воде или выбранном буфере, количественно определяют и хранят при -20°C. Очищенная ДНК может быть впоследствии использована в различных приложениях, которые включают, помимо прочего, ПЦР, сравнительную геномную гибридизацию на микрочипах 4 (array CGH), иммунопреципитацию метилированной ДНК (MeDIP) и секвенирование, что позволяет проводить интегративный анализ образцов тканей/опухолей.

Протокол

1. Замечания по процедуре

  • Ксилол и фенол являются токсичными химическими веществами и должны содержаться в fumehood. См. данные о безопасности материала (MSDS) перед использованием.
  • Ксилол растворяет некоторых пластмасс, полипропиленовые трубы должны быть использованы, как они переносят эти соединения.
  • Специальные советы могут быть приобретены, которые содержат внутреннюю пробку углем. Это предотвращает ксилола от разрыва каких резиновых деталей в пипетку. Кроме того, фильтр советы могут быть использованы.

2. Очистка от парафина

  1. В fumehood, добавьте 800 мкл ксилол (VWR, CABDH6216-4) с меченым пробирку, содержащую ваш образец и место на рокера с нежным встряхивания в течение 5 до 15 минут для растворения парафина.
  2. Пеллет образца спиннинг на максимальной скорости (14 000 оборотов в минуту или 16 000 мкг) в микроцентрифужных течение 3 минут. Аккуратно снять ксилол супернатант и распоряжаться в полипропиленовые трубы для отбросить в ксилоле отходов. Будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок.
  3. Повторить шаги ксилол мыть 1 и 2until парафин полного растворения. Это обычно требует 2:58 моет, в зависимости от размера образца ткани. Полного растворения образца появятся мягкие, а иногда теряет свою структурную целостность. Целостность образца может быть аккуратно оценивать с кончика пипетки.

3. Этанол регидратации

  1. Добавить 800 мкл 100% этанола (об. / об) молекулярной биологии этанол, вихревые, то спина в течение 3 минут при 14000 оборотов в минуту в микроцентрифужных. Удалить супернатант этанола, стараясь не потревожить осадок.
  2. Добавить 800 мкл 70% этанола (100% (об. / об) этанол разводят в дистиллированной воде (дН 2 O)), вихревые, и спина в течение 3 минут при 14000 оборотах в минуту. Осторожно удалите супернатант этанола.
  3. Добавить 800 мкл 50% этанола (100% (об. / об) этанол разводят в дистиллированной воде (дН 2 O)), вихревые, и спина в течение 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Осторожно удалить как можно больше этанола в качестве возможных с помощью пипетки. Будьте крайне осторожны в нарушении гранул в этот момент как полностью регидратации тканей не будет гранул, а также обезвоженные ткани.
  4. После удаления этанола супернатант, воздушно-сухих гранул в течение 5 минут, стараясь не более чем сухая.

4. Ткань пищеварения

  1. Добавить 200-500 мкл лизирующего буфера (формула ниже). Повторное приостановить осадок в наконечник пипетки или вихрь. Дополнительные усилия на данном этапе, чтобы полностью повторно приостанавливать ткани приведет к более полному усвоению образцов и лучший урожай ДНК.
  2. Инкубируйте образцов при 56 ° С на водяной бане или нагрева блока.
  3. Для ткани ядер, шипованные 20 мкл протеиназы К (20 мг / мл маточного раствора, Invitrogen, AM2548) утром и вечером.
  4. Повторить выше пищеварение шагах от 2 до 5 дней, пока ткань полностью растворился.

Лизис буфера

  • 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0
  • 100 мМ ЭДТА рН 8,0
  • 50 мМ NaCl
  • 0,5% SDS
  • 200 мкг / мл протеиназы К (добавить непосредственно перед употреблением)

    • 5. ДНК очистки

    1. Добавить равный объем буфера насыщенных фенола (Fisher, BP1750I-400) и микс от инверсии. Спиновые, по крайней мере, 5 минут при 14000 оборотов в минуту в микроцентрифужных.
    2. Передача водный слой в новую пробирку. Обратите внимание на межфазной: есть много белого материала?
    3. Повторите шаги 1 и 2 на водном долю до межфазной ясно (как правило, 3 и более раза). Выполните назад извлечения * при межфазных размыто увеличить конечный выход.
    4. После межфазной ясно, добавьте равное количество фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1) (Фишер, BP1752I-400) для извлечения водных часть своего образца. Смешайте в течение 5 минут, а затем спина в течение 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Thisreduces остаточной фенола и далее обостряет интерфазе, что облегчает извлечение водный слой
    5. Удалить водный слой в новую пробирку и treatwith РНКазы при 100 мкг / мл в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
    6. Повторить шаги с 1 по 4 для удаления остатков РНКазы и собирать водные фракции. Вы должны достаточно 1 или 2 буфера насыщенных фенола шаги, как не должно быть гораздо меньше белка, чтобы удалить, чем в исходном лизат.

    * Для выполнения резервного экстракции добавляют 50-100 мкл дН 2 0 на образец трубки, содержащей интерфазе и органической частью. Обратить трубки перемешать, и спина образца при 14 000 оборотов в минуту в микроцентрифужных течение 5 минут. Сбор водной фазы и добавить его к ранее приобретенной водной экстракции. Продолжить назад извлечений до межфазной ясно.

    6. ДНК осадков

    1. Оцените объем вашего собраны водный слой.
    2. Добавить 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия рН 5,2 и 1 объемом 100% изопропанола (об. / об) молекулярной биологии класс (или 2,5 объема 100% этанола).
    3. Хорошо перемешать и поставить на лед или в морозильной камере -20 ° C в течение 30 минут или на ночь.
    4. Spin на максимальной скорости (14 000 оборотов в минуту) при 4 ° С в микроцентрифужных в течение 10 минут
    5. Убрать супернатант.
    6. Мойте гранул с 70% ледяной этанола для удаления нежелательных солей.
    7. Re-приостановить пеллет в буфере выбора (как правило, дН 2 О).

    7. ДНК количественное

    1. Количественная концентрация ДНК. A260: A280 отношение должно быть ~ 1,8. Для небольших количеств ДНК, измерение с помощью NanoDrop спектрофотометр является предпочтительным.
    2. После количественного определения, гель-электрофореза должны быть выполнены, чтобы проверить качество Вашего анализа ДНК и определения загрязняющих РНК была полностью деградировали.
    3. Высокое качество извлечения ДНК, в настоящее время ниже по течению подходит для приложений, а также может храниться при температуре -20 ° C для дальнейшего использования. Если РНК-прежнему присутствует в вашей выборке, повторите ДНК очистки и осадки шаги, и вновь количественно и квалифицировать качество ваших образцов.

    Обсуждение

    Биопсии или хирургическим путем вырезали ткани для гистологического анализа и диагностики часто фиксированных формалином и залитые парафином (FFPE) для длительного хранения. С ростом интереса к пониманию генетической основы болезни, умение извлекать ДНК из этих образцов представляет бесценный источник диагностического материала, который может быть использован для геномного анализа и поступательное исследований. Исторически FFPE образцы не считается жизнеспособным источником для молекулярного анализа, как нуклеиновые кислоты могут быть сильно изменены белково-нуклеиновых и белок-белковые сшивки 6. Тем не менее, открытие, что протеазы пищеварения релизы фрагментирован нуклеиновых кислот, которые подходят для последующих анализов, включая ПЦР, массив CGH, последовательность и метилирования профилирование, позволяет использовать эти ценные образцы для генетического анализа 6.

    Экстракции ДНК из парафиновых срезах тканей является надежной процедурой, которая опирается на дифференциальные растворимости для очистки ДНК. Извлеченные качества ДНК и количество и успех последующей амплификации ДНК зависит от ряда параметров до, во время и после экстракции. Они включают, но не ограничиваются: тип и количество ткани, тип фиксатора используется для сохранения ткани, длительность фиксации, возраст блок парафина и условий хранения, а также длину желаемого сегмента ДНК, чтобы быть усиливается 1,7. Удаление парафина из тканей является наиболее важным шагом для успешного извлечения как нерастворенных парафина приводит к ухудшению качества образца и ингибирование ПЦР.

    Раскрытие информации

    Нет конфликта интересов объявлены.

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Лам для их оценки и критика этого видео и статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств канадского института исследований в области здравоохранения.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Имя Компания Номер по каталогу Комментарии
    Ксилол VWR CABDH6216-4 -
    1,7 мл SafeSeal Трубы Микроцентрифуга Sorenson BioScience 11510 -
    Spectrafuge 16М Микроцентрифуга LABNET C0160-B -
    Лизис буфера - - 10 мМ Трис-HCl PH8,
    100 мМ ЭДТА рН 8,
    50 мМ NaCl,
    0,5% SDS,
    200 мкг / мл протеиназы К
    Протеиназы К маточного раствора Invitrogen AM2548 20 мг / мл
    Протеиназы К маточного раствора
    Буфер Насыщенные Фенол рН 6.6/7.9 Рыболов BP1750I-400 -
    Фенол: хлороформ: изоамилового спирта (25:24:1, рН 6.7/8.0) Рыболов BP1752I-400 -
    РНКазы Roche 10109169001 100 мг
    3М ацетата натрия рН 5,2 - - 40.81g NaOAc в 80 мл
    Отрегулируйте до рН 5,2 ледяной уксусной кислотой
    Добавить дН 2 O в 100 мл
    Автоклав
    Н. Д. 3300 Спектрофотометр NanoDrop - -

    Ссылки

    1. Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
    2. Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
    3. Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
    4. Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
    5. Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
    6. Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
    7. Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    K

    Похожие статьи