Описан способ подготовки одной живой клетки фоторецепторов из разных видов позвоночных для флуоресцентной визуализации. Метод может быть использован для изображений флуоресценции эндогенных флуорофоров, таких как NADH или витамин А, или, что из экзогенно добавил флуоресцентные красители чувствительны к Са 2 + Или других факторов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка Жизнь Изолированные позвоночных фоторецепторных клеток для флуоресценции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В сетчатке позвоночных фототрансдукция — преобразование света в электрический сигнал — осуществляется палочкообразными и колбочкообразными фоторецепторными клетками1-4. Палочки отвечают за зрение при слабом освещении, колбочки — при ярком. Фототрансдукция происходит во внешнем сегменте фоторецепторной клетки, специализированном отделе, содержащем высокую концентрацию зрительного пигмента, который служит основным детектором света. Зрительный пигмент состоит из хромофора, 11-cis-ретиналя, связанного с белком опсином. Фотон, поглощенный зрительным пигментом, вызывает изомеризацию хромофора из 11-cis в all-trans-форму. Эта фотоизомеризация вызывает конформационное изменение зрительного пигмента, которое запускает каскад реакций, завершающихся изменением мембранного потенциала и преобразованием светового стимула в электрический сигнал. Восстановление клетки после светового воздействия включает деактивацию промежуточных продуктов, активированных светом, и восстановление мембранного потенциала. Ca2+ модулирует активность нескольких ферментов, участвующих в фототрансдукции, и его концентрация снижается при световом воздействии. Таким образом, Ca2+ играет важную роль в восстановлении клетки после светового стимула и ее адаптации к фоновому освещению.
Другим важным этапом процесса восстановления является регенерация зрительного пигмента, который был разрушен в ходе детектирования света вследствие фотоизомеризации его 11-цис-хромофора в all-транс-форму5-7. Эта регенерация начинается с высвобождения all-транс-ретиналя фотоактивированным пигментом, в результате чего остается апобелок опсин. Высвобожденный all-транс-ретиналь быстро восстанавливается в реакции с использованием NADPH до all-транс-ретинола, а опсин соединяется с новым 11-цис-ретиналем, поступающим во внешний сегмент, для повторного формирования зрительного пигмента. Затем all-транс-ретинол переносится из внешнего сегмента в соседние клетки с помощью специализированного белка-переносчика — межфоторецепторного ретиноидосвязывающего белка (IRBP).
Флуоресцентная визуализация отдельных фоторецепторных клеток может быть использована для изучения их физиологии и клеточной биологии. Ca2+-чувствительные флуоресцентные красители позволяют детально исследовать взаимосвязь между изменениями концентрации Ca2+ в наружном сегменте и ответом на свет8-12, а также роль депо Ca2+ во внутреннем сегменте в поддержании Ca2+-гомеостаза13,14. Флуоресцентные красители также могут применяться для измерения концентрации Mg2+15, pH и в качестве маркеров водного и мембранного компартментов16. Наконец, собственная флуоресценция all-trans-ретинола (витамина А) может быть использована для мониторинга кинетики его образования и удаления в отдельных фоторецепторных клетках17-19.
Протокол
1. Подготовка Sylgard покрытых блюд, экспериментальной камеры, и бритвенных лезвий
- 35 мм Сокол чашки Петри покрытые эластомера Sylgard необходимы для надлежащего колки изолированной сетчатки получить отдельные клетки фоторецепторов. Эластомер получают в соответствии с инструкциями поставщика и небольшое количество наливают в каждое блюдо, чтобы покрыть дно слой. Замените блюдо охватывает после нанесения покрытия и хранить их. Через несколько дней эластомер твердеет и блюда будут готовы.
- Изолированные фоторецепторы должны придерживаться нижней части экспериментальной камеры, чтобы они были иммобилизованным в ходе визуализации эксперимента. Это дос....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Если здоровый изолированных клеток не получено, проблема заключается либо с изоляцией или здоровья сетчатки или с ее измельчать. Как правило, после удаления передней части глаза и стекловидное тело, сетчатку легко отрывается от земли пигментного эпителия. Если этого не произойдет, попробуйте очистить его от начиная с периферии наглазник. Если он все еще трудно отделить, что вполне возможно, что животное не было темно-адаптированы для соответствующего периода времени, или красный свет слишком яркий. Обеспечить надлежащее.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Поддержка НОУ грант EY014850.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Имя | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Темная комната (100-150 футов 2) | |||
| Красные огни 19 | Интернет-магазины | ||
| Инфракрасные источники света и инфракрасного изображения зрители | FJW Оптический Systems, Inc | ||
| Пройдя через микроскоп 19 | Оснащенный инфракрасным зрителей | ||
| Epifluorescence микроскопом заключен в светонепроницаемый клетке 19 | |||
| Пройдя инструменты (ножницы, пинцет, лезвие держатель) | Roboz или изобразительных инструментов науки | ||
| Sylgard эластомера | Эссекс (Charlotte, NC) | Sylgard 184 эластомера комплект | |
| Поли-L-орнитин (0,01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Поли-L-лизин (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Развести до 0,01% |
| Экспериментальные камер | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Чашки Петри, пипетки пластиковые | Fisher Scientific |
Ссылки
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Ko....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
