Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка Жизнь Изолированные позвоночных фоторецепторных клеток для флуоресценции

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2789

⸱

22 июня 2011 г.

 ,  , 
1Storm Eye Institute, Medical University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Описан способ подготовки одной живой клетки фоторецепторов из разных видов позвоночных для флуоресцентной визуализации. Метод может быть использован для изображений флуоресценции эндогенных флуорофоров, таких как NADH или витамин А, или, что из экзогенно добавил флуоресцентные красители чувствительны к Са 2 + Или других факторов.

Аннотация

В сетчатке позвоночных фототрансдукция — преобразование света в электрический сигнал — осуществляется палочкообразными и колбочкообразными фоторецепторными клетками1-4. Палочки отвечают за зрение при слабом освещении, колбочки — при ярком. Фототрансдукция происходит во внешнем сегменте фоторецепторной клетки, специализированном отделе, содержащем высокую концентрацию зрительного пигмента, который служит основным детектором света. Зрительный пигмент состоит из хромофора, 11-cis-ретиналя, связанного с белком опсином. Фотон, поглощенный зрительным пигментом, вызывает изомеризацию хромофора из 11-cis в all-trans-форму. Эта фотоизомеризация вызывает конформационное изменение зрительного пигмента, которое запускает каскад реакций, завершающихся изменением мембранного потенциала и преобразованием светового стимула в электрический сигнал. Восстановление клетки после светового воздействия включает деактивацию промежуточных продуктов, активированных светом, и восстановление мембранного потенциала. Ca2+ модулирует активность нескольких ферментов, участвующих в фототрансдукции, и его концентрация снижается при световом воздействии. Таким образом, Ca2+ играет важную роль в восстановлении клетки после светового стимула и ее адаптации к фоновому освещению.

Другим важным этапом процесса восстановления является регенерация зрительного пигмента, который был разрушен в ходе детектирования света вследствие фотоизомеризации его 11-цис-хромофора в all-транс-форму5-7. Эта регенерация начинается с высвобождения all-транс-ретиналя фотоактивированным пигментом, в результате чего остается апобелок опсин. Высвобожденный all-транс-ретиналь быстро восстанавливается в реакции с использованием NADPH до all-транс-ретинола, а опсин соединяется с новым 11-цис-ретиналем, поступающим во внешний сегмент, для повторного формирования зрительного пигмента. Затем all-транс-ретинол переносится из внешнего сегмента в соседние клетки с помощью специализированного белка-переносчика — межфоторецепторного ретиноидосвязывающего белка (IRBP).

Флуоресцентная визуализация отдельных фоторецепторных клеток может быть использована для изучения их физиологии и клеточной биологии. Ca2+-чувствительные флуоресцентные красители позволяют детально исследовать взаимосвязь между изменениями концентрации Ca2+ в наружном сегменте и ответом на свет8-12, а также роль депо Ca2+ во внутреннем сегменте в поддержании Ca2+-гомеостаза13,14. Флуоресцентные красители также могут применяться для измерения концентрации Mg2+15, pH и в качестве маркеров водного и мембранного компартментов16. Наконец, собственная флуоресценция all-trans-ретинола (витамина А) может быть использована для мониторинга кинетики его образования и удаления в отдельных фоторецепторных клетках17-19.

Протокол

1. Подготовка Sylgard покрытых блюд, экспериментальной камеры, и бритвенных лезвий

  1. 35 мм Сокол чашки Петри покрытые эластомера Sylgard необходимы для надлежащего колки изолированной сетчатки получить отдельные клетки фоторецепторов. Эластомер получают в соответствии с инструкциями поставщика и небольшое количество наливают в каждое блюдо, чтобы покрыть дно слой. Замените блюдо охватывает после нанесения покрытия и хранить их. Через несколько дней эластомер твердеет и блюда будут готовы.
  2. Изолированные фоторецепторы должны придерживаться нижней части экспериментальной камеры, чтобы они были иммобилизованным в ходе визуализации эксперимента. Это достигается за счет покрытия днища камеры с поли-L-лизин или поли-L-орнитина. Добавить 200 мкл 0,01% раствора или по одному в камере, и крышка камеры с бумажным полотенцем, чтобы защитить их от пыли. После того как раствор высохнет, смойте камеры с дистиллированной водой и хранят в фургон. Используйте в течение 2 недель.
  3. Для очистки камер в конце эксперимента, промойте их 100%-ным этанолом для удаления нефти с нефтью погружения линз и сотовых мусора. Для удаления ячейки мусора, использование хлопка наконечником аппликатора и тщательно мыть нижней части камеры. Затем промыть дистиллированной водой и дайте высохнуть перед камерами повторного покрытия.
  4. Вырезать обоюдоострым лезвием бритвы на небольшие кусочки (8 из одного лезвия) с металлическим резаком.

2. Приготовление растворов

  1. Состав решений зависит от вида. Для амфибий, Рингера имеет (в ммоль / л): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, рН = 7,55. РН должен быть настроен на конечного значения с NaOH. Для млекопитающих, Рингера имеет (в ммоль / л): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 2 MgCl, CaCl 2 2, 25 hemisodium-HEPES, рН = 7,40. Решение Рингера может храниться хорошо запечатаны при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
  2. Сток раствора глюкозы, 1 моль / л, хранится при температуре -20 ° С, чтобы избежать роста бактерий.
  3. В день эксперимента, добавить глюкозу к решению Рингера до конечной концентрации 5 ммоль / л В конце концов, отказаться от Рингера, который содержит глюкозу, поскольку это может расти бактерии.

3. Выделение сетчатки

  1. Для надлежащего иссечение сетчатки важно, чтобы животное быть темно-адаптированных, по крайней мере за 2-3 часа до жертвы. Животные должны быть темно-адаптирована в подходящем контейнере в вентилируемом темном зале.
  2. Заполните два 35-мм чашки Петри на полпути с раствором Рингера.
  3. Жертвы животных под тусклый красный свет и удалить глаз. Впоследствии все процедуры проводятся под инфракрасный свет, используя рассекает микроскопа или камеры с видео монитор.
  4. Удалите все остатки ткани от внешней поверхности глаза. Вырезать и удалить передней части, а затем перенести наглазник в одну из чашек Петри заполнены Рингера.
  5. Удаление стекловидного тела и тщательно отделить сетчатку от остальной наглазник, зажимая выключен или резки любые вложения. Аккуратно поднимите сетчатки и отделить его полностью от наглазник.
  6. Передача сетчатки на второй чашке Петри с пластиковой пипеткой передачи. Держите блюдо с сетчатки в светонепроницаемый ящик.

4. Выделение отдельных клеток фоторецепторов

  1. Все процедуры проводятся под инфракрасным излучением. Отрежьте небольшой кусочек сетчатки и перенести его с пластиковой пипеткой Sylgard покрытые блюдо. Объем раствора, содержащего сетчатки кусок должен быть около 250 мкл.
  2. Возьмите небольшой кусочек лезвия бритвы с лезвием держатель - край лезвия должны быть примерно под углом 45 ° к держателю. Свести часть сетчатки на слое Sylgard и используя лезвие нарезать кусок сетчатки мелко, сохраняя при этом он придерживался слой Sylgard.
  3. Передача 200 мкл раствора, содержащего клетки экспериментальной камеры - оставьте все оставшиеся части сетчатки в Sylgard покрытые блюдо. Держите камеру с изолированными клетками в светонепроницаемый ящик.
  4. Подождите 10 минут для клеток на поселение, затем добавьте 2-3 мл Рингера. На данном этапе, изолированных клеток могут быть загружены с особым флуоресцентным красителем (например Фура-2) в соответствии с красителем протокол загрузки.
  5. Теперь клетки могут быть приняты для столике микроскопа для экспериментов.

5. Флуоресценции

  1. Передача камеры этапе epifluorescence микроскопом. Отрегулируйте решение перфузии, датчиков температуры, инфракрасную подсветку, и т.д.
  2. Закрыть шторы и начать эксперимент. Включите ИК-света внутри микроскопа клетку, сосредоточить внимание на нижнюю часть экспериментальной камере, и двигаться этапе ищет клеток.

6. Представитель Результатс:

Рис. 1 показана морфология здоровый изолированных палочек и колбочек, фоторецепторы, полученные с применением протокола от саламандра (Ambystoma tigrinum) сетчатки. Salamander клетки широко используются для одной ячейки флуоресценции исследования изображений из-за их больших размеров и их способность выживать в течение нескольких часов после изоляции от сетчатки. Кроме того, от сетчатки саламандры можно регулярно получать как палочек и колбочек фоторецепторов.

Одним из важных критериев для здоровья клетки является наличие интактной эллипсоид (рис. 1), часть клетки, где сосредоточены митохондрии. Когда клетки рассматриваются под DAPI оптики, эта концентрация митохондрий дает сильный сигнал флуоресценции (рис. 2) из-за присутствия NADH. Отсутствие нетронутыми эллипсоида знак поврежденной клетки, как правило, непригодны для эксперимента. Рис. 3 показаны поврежденные саламандра стержень фоторецепторов, с опухшим тело клетки и конденсированных ядра. Такие клетки дисплей намного ниже флуоресценции под DAPI оптика, но смотреть под FITC оптики показывают сильный сигнал ФАД в эллипсоид регионе (информация, поступающая из окисленных флавин нуклеотидов и флавопротеидов). Еще один критерий для здоровья изолированных фоторецепторов является их способность генерировать полностью транс-ретинол (витамин А) в их наружных сегментов при стимуляции светом. Поколения витамина требует значительного количества НАДФН, который зависит от нетронутыми техники обмена веществ. На рисунках 4 и 5 показывают, образование витамина А в наружных сегментах интактных лягушки и мыши фоторецепторов стержня соответственно.

Рисунок 1
Рисунок 1. Здоровый одного фоторецепторов палочек и колбочек. Клетки были изолированы от сетчатки глаза тигра саламандры. Фототрансдукции происходит во внешнем сегменте и эллипсоид плотно с митохондриями. Палочки отвечают за тусклом свете видения, конусы для яркого видения света.

Рисунок 2
Рисунок 2. Флуоресценция жизни саламандр палочек и колбочек. Это темно-адаптированы клетки, показывая сильную флуоресценцию NADH в своих эллипсоидов и никаких существенных витамина флуоресценции в их наружных сегментов. Захват флуоресценции изображение представляет свой первый воздействия видимого света после периода темно-адаптации.

Рисунок 3
Рисунок 3. Поврежденные саламандра стержень фоторецепторов. Опухшие тело клетки и конденсированных ядра указывают на повреждение. Ячейка окисляется и есть минимальное сигнал NADH (DAPI оптики), но гораздо сильнее, ФАД сигнала (FITC оптики).

Рисунок 4
Рисунок 4. Лягушка стержень с NADH и ретинола. Это здоровый стержень фоторецепторов лягушки показывает сильную флуоресценцию NADH в эллипсоид регионе. Перед освещенности есть минимальное флуоресценции во внешнем сегменте. После воздействия света, есть значительное увеличение внешнего флуоресценции сегмента в связи с образованием витамина А.

Рисунок 5
Рисунок 5. Мышь стержень с ретинолом. Это здоровый фоторецепторов стержня мыши показывает значительный внешний сегмент флуоресценции после воздействия света в связи с образованием витамина А. эллипсоида регионов фоторецепторов мыши стержень не показывают сильного сигнала флуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Если здоровый изолированных клеток не получено, проблема заключается либо с изоляцией или здоровья сетчатки или с ее измельчать. Как правило, после удаления передней части глаза и стекловидное тело, сетчатку легко отрывается от земли пигментного эпителия. Если этого не произойдет, попробуйте очистить его от начиная с периферии наглазник. Если он все еще трудно отделить, что вполне возможно, что животное не было темно-адаптированы для соответствующего периода времени, или красный свет слишком яркий. Обеспечить надлежащее...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Поддержка НОУ грант EY014850.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Имя Компания Номер в каталоге Комментарии
Темная комната (100-150 футов 2)
Красные огни 19 Интернет-магазины
Инфракрасные источники света и инфракрасного изображения зрители FJW Оптический Systems, Inc
Пройдя через микроскоп 19 Оснащенный инфракрасным зрителей
Epifluorescence микроскопом заключен в светонепроницаемый клетке 19
Пройдя инструменты (ножницы, пинцет, лезвие держатель) Roboz или изобразительных инструментов науки
Sylgard эластомера Эссекс (Charlotte, NC) Sylgard 184 эластомера комплект
Поли-L-орнитин (0,01%) Sigma-Aldrich P4957
Поли-L-лизин (0,1%) Sigma-Aldrich P8920 Развести до 0,01%
Экспериментальные камер Warner Instruments (Hamden, CT) D3512P
Чашки Петри, пипетки пластиковые Fisher Scientific

Ссылки

  1. Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
  2. Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
  3. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in Vertebrate Photoreceptors. Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).
  4. Palczewski, K. G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).
  5. Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
  6. Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
  7. Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
  8. Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
  9. Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
  10. Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
  11. Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
  12. Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
  13. Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
  14. Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
  15. Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
  16. Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
  17. Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
  18. Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
  19. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
  20. Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
  21. Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
  22. Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Изоляция сетчаткиподготовка клетокэкспериментальная камерафизиологический растворинфракрасный светпредметный столик микроскопаоценка жизнеспособности клетокфлуоресценция ретинола
Подготовка Жизнь Изолированные позвоночных фоторецепторных клеток для флуоресценции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.