В этой статье описывается В пробирке Технике для контроля раковых клеток вторжение через монослой эндотелиальных клеток. Данные получают в режиме реального времени в зависимости от изменений импеданса на поверхности электродов на забое скважины.
Методическая статья
В режиме реального времени Электрические характеристики Сопротивление техника выполнения измерить Вторжение клеточный монослой эндотелиальных раковыми клетками
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метастатическое распространение злокачественных клеток требует деградации базальной мембраны, прикрепления опухолевых клеток к сосудистому эндотелию, раскрытия эндотелиальных соединений и, наконец, инвазии и миграции опухолевых клеток через эндотелиальный слой для попадания в кровоток, который служит средством транспортировки в отдаленные области организма хозяина1-3. Попав в кровеносную систему, раковые клетки прикрепляются к стенкам капилляров и выходят за пределы сосудов (экстравазируют) в окружающую ткань, образуя метастатические опухоли4,5. Различные компоненты взаимодействия опухолевых клеток с эндотелиальными клетками могут быть воспроизведены in vitro путем воздействия раковых клеток на монослой эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). Исследования, проведенные с помощью электронной и фазово-контрастной микроскопии, позволяют предположить, что последовательность событий in vitro достаточно точно представляет метастатический процесс in vivo6. В данном материале мы описываем метод на основе измерения электрического импеданса, который позволяет в режиме реального времени отслеживать и количественно оценивать инвазию эндотелиальных клеток злокачественными опухолевыми клетками.
Дживер и Киз впервые описали метод измерения колебаний импеданса при росте популяции клеток на поверхности электродов7,8. Прибор xCELLigence производства компании Roche использует аналогичный метод для измерения изменений электрического импеданса по мере прикрепления и распластывания клеток в культуральной чашке, дно которой покрыто массивом золотых микроэлектродов, занимающим примерно 80% площади лунки. Прикрепление и распластывание клеток на поверхности электродов приводит к увеличению электрического импеданса9-12. Импеданс отображается как безразмерный параметр, называемый клеточным индексом (cell-index), который прямо пропорционален общей площади дна лунки для культивирования тканей, покрытой клетками. Таким образом, клеточный индекс может быть использован для мониторинга адгезии, распластывания, морфологии и плотности клеток.
Метод анализа инвазии, описанный в данной статье, основан на изменении электрического импеданса на границе электрода и клеток при инвазии популяции злокачественных клеток через монослой HUVEC (Рисунок 1). Разрушение эндотелиальных соединений, сокращение площади эндотелиального монослоя и его замещение опухолевыми клетками приводят к значительным изменениям импеданса. Эти изменения напрямую коррелируют с инвазивной способностью опухолевых клеток: так, инвазия высокоагрессивных клеток вызывает резкие изменения импеданса, и наоборот. Данный метод обладает двойным преимуществом перед существующими способами измерения инвазии, такими как анализ в камерах Бойдена или на матригеле: 1) взаимодействие эндотелиальных клеток и опухолевых клеток более точно имитирует процесс in vivo, и 2) данные получаются в режиме реального времени и легче поддаются количественному анализу, в отличие от конечного анализа, используемого в других методах.
Протокол
1. Подготовка
- Все шаги должны быть выполнены в стерильных условиях в капюшоне культуры ткани.
- XCELLigence станция находится в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% CO 2.
- Использование низкого прохода HUVEC клетки, предпочтительно не более чем канал 6. Кроме того, убедитесь, что клетки являются не более чем на 75% сливной во время сбора урожая.
- HUVEC клетки выращивают в EGM-2 среды восстанавливают EGM-2 пули комплект (Lonza Biosciences), содержащий факторы роста, добавки и 5% фетальной бычьей сыворотки.
- Все следы трипсин должна быть удалена из суспензии клеток формованием клеток при 200xg, промыванием один раз PBS, и повторное суспендирование их в указанные плотности клеток.
- Coat xCELLigence E-пластины 16 с 0,1% желатина в течение 1 часа при температуре 37 ° С или в течение ночи при 4 ° С. Мойте тарелку с PBS и добавьте 100 мкл восстановленного EGM-2 СМИ. Выполните с контрольными замерами на xCELLigence системы для измерения фонаимпеданс в отсутствие клеток.
2. Создание HUVEC монослоя
- Урожай суб-сливающийся Настой HUVEC клетки трипсинизацией. Ресуспендируют клеток в восстановленной EGM-2 средства массовой информации до конечного плотностью 2,5 х 10 5 клеток / мл.
- В каждую лунку фон калиброванный E-планшет, содержащий 100 мкл EGM-2 среды, добавляют 100 мкл суспензии клеток HUVEC (2,5 × 10 4 HUVEC клетки).
- Немедленно установите E-Plate в xCELLigence инструмента.
- Программное обеспечение для выполнения xCELLigence импеданс показания с 10-минутными интервалами.
- Пусть эндотелиальные клетки расти в течение 18-21 часов, пока они не образуют монослой, о чем свидетельствует уплощение индекс ячейки (рис. 2).
3. Добавление вторжения в клетки и нормализация данных.
- После стабильного монослоя HUVEC сформировалась, урожай опухолевых клеток трипсинизацией и ресуспендируют до конечного притоновность 1 × 10 5 клеток / мл в среде для выращивания клеток опухоли (например, DMEM или RPMI, содержащей 10% FBS)
- Пауза импеданс показания xCELLigence программного обеспечения и удалить E-Plate от станции.
- Удалить EGM-2 СМИ аспирации. Добавьте 100 мкл суспензии клеток опухоли, содержащей 1 х 10 4 клеток. Как правило, соотношение 1:2,5 опухолевых клеток: эндотелиальные клетки высевают, лучше всего подходит для анализа. Однако это соотношение может быть оптимизирована для отдельных клеточных линий.
- Поместите E-пластина на xCELLigence системы в инкубаторе и продолжить сопротивление показания с 10-минутными интервалами.
- Вторжение можно отслеживать в режиме реального времени в течение следующих 6-12 часов, как капля в индекс ячейки из-за втягивания эндотелиальные соединения и проникновения вторжение опухолевых клеток.
- Нормализация результатов время добавления вторжение опухолевых клеток. XCELLigence программное обеспечение дает возможность нормализации в любую точку времени и результатыможет быть непосредственно рассматривать в окне программы.
4. Представитель Результаты:
Примером HUVEC монослоя вторжения метастатического и не метастатических клеток показано на рисунке 3. K7M2 является метастатическим клеточной линии остеосаркомы. Эти клетки экспрессируют высокие уровни белка цитоскелета эзрина компоновщик, на долю которого приходится инвазивных свойств этой клеточной линии 13,14. Когда HUVEC клетки заражают K7M2 клетки, происходит падение электрического сопротивления в течение 6 часов. Это падение электрического сопротивления представляет вторжение в HUVEC монослоя вторжения в клетки опухоли. K12 клеточной линии, с другой стороны, выражает гораздо более низкие уровни эзрина и, следовательно, менее метастатических 13. Оспаривание HUVEC монослоя с K12 клетках приводит к менее резкое падение сопротивления как клетки не способны придерживаться или вторгаться через монослоя HUVEC (рис. 3).
Рисунок 1. Принципиальная схема работы процесса для вторжения эндотелиальных клеток опухолевыми клетками. HUVEC клетки высевают на покрытые желатином E-пластины и позволило сформировать монослой. Злокачественные клетки добавляются раз в монослой сформировался и инвазия контролируется в режиме реального времени, как индекс ячейки изменяется из-за вторжения в эндотелиальных монослой.
Рисунок 2. HUVEC монослоя. Изменения в индекс ячейки как HUVEC клетки придают и распространяется на покрытые желатином золотыми электродами. Формирование монослоя представлен стабилизации клеточных индекс после 18 часов.
Рисунок 3. Вторжение HUVEC клеток K7M2 и K12 клетки остеосаркомы. Резким сокращением челл индекса происходит в течение нескольких часов после введения высокой метастатической K7M2 клеток. K12 клетки, с другой стороны, менее метастатического и не могут проникать через монослой эндотелиальных же эффективно, как K7M2 клеток. Это представлено менее резкое снижение в клетке, когда индекс монослоя HUVEC стоит задача с K12 клеток. Управление представляет импеданс HUVEC монослоя в отсутствие раковых клеток. Эксперименты проводили в трех повторностях.
Обсуждение
В режиме реального времени вторжения HUVEC анализ является простой, но мощный метод мониторинга вторжения. Он предоставляет результаты в реальном времени, что является существенным преимуществом по сравнению с другими традиционными методами, которые опираются на анализ конечных результатов. Анализ может быть модифицирован, чтобы тестируемые лекарства, антитела, лиганды и белков в качестве ингибиторов или стимуляторов метастазов. Влияние различных агентов на эндотелиальных / раковых клеток перекрестных помех может быть оценена также. При введении экзогенных агентов, таких как факторы роста и препаратов в культуральной среде, важно, чтобы гарантировать, что они не оказывают влияния на целостность монослоя HUVEC. Разрушение монослоя HUVEC может быть проверена путем введения экзогенных агентов в отсутствие вторжения в клетки, и обеспечение того, нет никаких изменений в клеточной индекса. Таким образом, соответствующие элементы управления, должны быть включены как часть эксперимента.
Различные клеточные линии демонстрируют различные клетки-индекс кривые как они образуют конфluent монослоя. Форма кривой, а также максимальное клеточного индекс достигнута, является типом клеток конкретными. HUVEC клетки показывают характеристика переходных уплощение индекс ячейки 4-6 часов после посева, а затем еще стабилизации на более высоком индексе клетки после 16-18 часов. Следовательно, крайне важно, чтобы клетки образуют монослой по крайней мере 18 часов перед добавлением клеток опухоли.
Поскольку индекс ячейки зависит от ионной среде на границе электрод / клетка интерфазы различных факторов, таких как клеточной морфологии и качество межклеточных спаек влияние на клетки-индекс, в дополнение к области хорошо дно покрыты. Таким образом, снижение в ячейке индекс, который происходит при инвазии опухоли клетки, является функцией нескольких факторов, которые включают в себя отвода эндотелиальных соединений и последующее вторжение опухолевых клеток.
XCELLigence инструмент изготовлен в трех различных конфигурациях: анализатор реального времени клетки(RTCA) SP, MP и RTCA RTCA DP. Прибор RTCA SP занимает одно 96-а E-пластины в то время как прибор RTCA MP может вместить до шести 96-а E-пластин одновременно. Это позволяет для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов и соединений. Эксперименты в этой статье, выполняются с помощью инструмента RTCA DP, которое можно провести три 16-а E-пластин. Каждая пластина E-Холдинг станция может самостоятельно работать, что позволяет многим пользователям запускать экспериментов одновременно. Прибор RTCA DP также может быть использован для изучения миграции с использованием CIM-пластин. Эти 16-луночных планшетах с верхней и нижней камеры, разделенные полиэтилентерефталата (ПЭТ) мембраны со средним размером пор 8um. Электронные датчики расположены на нижней пористой мембраны из верхней камеры. Нижняя камера служит в качестве резервуара для хемоаттрактантных для клеток в верхней камере. Тем не менее, одним из основных преимуществ HUVEC анализа вторжение на CIM пластины является то, что инвазии опухоли клетки в бывшем яы не ограничивается размером пор, как эндотелиальные инвазии клеток зависит от перекрестных помех между опухолью и эндотелиальных клетках.
HUVEC анализа вторжения может быть также выполнена на инструменте ЕСНГ Z, выпускаемых прикладной биофизики (Троя, штат Нью-Йорк). Прибор ЕСНГ Z использует технологию, подобную xCELLigence инструментом, с различиями в массиве и конфигурации электродов. Мы успешно выступили HUVEC анализов вторжения помощью 8-и массивы Восточной Европы и СНГ. Важно отметить, что хорошо нижней поверхности область больше, в ЕСНГ массивы, который требует большего числа эндотелиальных и опухолевых клеток, что покрытие: 2,5 × 10 5 и 1 × 10 5 клеток соответственно.
Раскрытие информации
Расходы на публикацию этой рукописи была любезно предоставлена Roche Applied Science.
Благодарности
Эта работа получила щедрую поддержку за счет средств детского онкологического фонда (Балтимор, Мэриленд), Брэндон Ли Кэррингтон Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) и NIH (R01CA108641).
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Антона Wellstein и члены его лаборатории для обмена опытом и помогает нам оптимизировать представленные методы.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| станция xCELLigence RTCA DP |  Группа Roche | 05469759001 | |
| блок управления RTCA | Группа Roche | 05454417001 | Ноутбук с предустановленным программным обеспечением RTCA |
| E-Plate 16 | Группа Roche | 05469830001 | |
| клетки HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| среда EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| набор пуль EGM-2 | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0,1% желатин в стерильном H2О | EMD Millipore | MCPROTO045 |
Ссылки
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
Перепечатки и разрешения
