Методическая статья

Оценка наночастиц в опухоли в реальном времени с помощью Прижизненные изображения

DOI:

10.3791/2808

⸱

21 июня 2011 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Western Ontario, 2London Regional Cancer Program, London Health Science Centre, 3Department of Pathology, Vanderbilt University , 4Translational Prostate Cancer Research Group, London Health Science Centre

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем новый подход к количественному наночастиц локализации в сосудистой от человека xenografted опухолей с использованием динамических, в режиме реального времени прижизненных изображений в модели птичьего эмбриона.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Современные технологии для визуализации опухоли, такие, как УЗИ, МРТ, ПЭТ и КТ, не в состоянии уступить изображений высокого разрешения для оценки наночастиц в опухолях на микроскопическом уровне 1,2,3, подчеркивая полезность подходящую модель ксенотрансплантата , в которых проводить детальный анализ поглощения. Здесь мы используем высоким разрешением прижизненной визуализации для оценки наночастиц в опухоли человека ксенотрансплантаты в модифицированном, раковины менее куриного эмбриона модели. Модель куриный эмбрион особенно хорошо подходят для этих анализов в естественных условиях, поскольку он поддерживает рост опухолей человека, является относительно недорогим и не требует анестезии или хирургического вмешательства 4,5. Опухолевые клетки образуют полностью васкуляризированной ксенотрансплантаты в течение 7 дней, когда имплантируется в chorioallantoic мембраны (CAM) 6. В результате опухоли визуализируются с помощью неинвазивных в реальном времени с высоким разрешением изображения, которые могут быть сохранены в течение 72 часов с минимальным воздействием на любой хост или опухоли систем. Наночастицы с широким диапазоном размеров и составов вводить дистальнее опухоли могут быть визуализированы и количественно по мере их прохождения через кровь, вытекать из сосудов в ткань с вытекающей сосудистая опухоль, и накапливаются в опухоли. Мы описываем здесь анализ наночастиц основе вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), украшенная ближней инфракрасной флуоресцентные красители и / или полиэтиленгликоль полимеров (ПЭГ) 7, 8, 9,10,11. После внутривенного введения этих вирусных наночастиц быстро усвоены эндотелиальных клеток, что приводит к глобальной маркировки сосудистую как снаружи, так и внутри опухоли 7,12. PEGylation от вирусных наночастиц увеличивает их полувыведения, расширяет свое время в обращении, и в конечном итоге повышает их накопления в опухоли через повышенной проницаемости и удержания (ЭПР) эффект 7, 10,11. Скорость и степень накопления наночастиц в опухоли измеряется в течение долгого времени с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Этот метод дает метод как визуализировать и количественно наночастиц динамики в опухолях человека.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Прививка от опухоли в CAM птичьего эмбриона

  1. Подготовка оболочки менее оплодотворенных эмбрионов куриных, как описано 8.
  2. На 9-й день эмбрионального развития, собрать микро-инжектор использованием 18-иглы подключены на 1 мл шприца. Вырезать 5-6 дюймов кусок Tygon трубки (1 / 32 "внутренний диаметр, 3 / 32" наружный диаметр, 1 / 32 "толщина стенки) и аккуратно вставьте скос иглы в трубку. Примерно 4-5 дюймов трубки должны простираются от кончика иглы (рис. 1а).
  3. Заполните шприц и трубку с клеточной суспензии. Затем вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы и тщательно удалить пузырьки воздуха.
  4. Inject День 9 эмбрионов (рис. 1б) при вскрытии прицел с подсветкой с 10000-100000 раковые клетки в виде болюса в течение CAM (рис. 1в). Медленно вводить клетки и тщательно обеспечить, чтобы игла находится в правильном месте для клеток для формирования видимых болюсно в CAM. Клетки, которые капать на поверхность CAM можно чистить с помощью Kimwipe или других аппликатора.
  5. Вернуться эмбрионов увлажненный инкубаторе при температуре 38 ° С при влажности 60% и позволяет опухоли расти и vascularize (до 7 дней).

2. Подготовка наночастиц

  1. Для подготовки флуоресцентно меченных CPMV наночастиц для введения в куриный эмбрион, разбавленный вирусных наночастиц (синтезируется как в 8 в PBS, рН 7,4, до концентрации 100 мкг / мл смеси Vortex задолго до того, использование и центрифуги в течение одной минуты, чтобы удалить. агрегатов. ультразвука также может быть полезна в зависимости от конъюгатов и степени агрегации. Запасы флуоресцентно меченных CPMVs стабильны в течение не менее 1 года при условии хранения при 4 ° С в темноте. Проверьте запасы периодически, поставив пару капель на предметное стекло и проверка флуоресценции. просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) также может быть использован для определения того, частицы остались нетронутыми после сопряжения.
  2. Короче говоря, один микрограмм вирусных наночастиц (в конечном объеме 2 мкл) могут быть добавлены к медным покрытием сетки. Затем добавьте равный объем 2% уранилацетата в течение 1 минуты на электронном микроскопе (Philips EM 410).

3. Внутривенное введение флуоресцентно меченных вирусных наночастиц

  1. На 16 день, сборки микро-инжектор, как описано выше. Составление требуемого объема вирусных наночастиц через шланг в шприц (> 200 мкл). Осторожно удалите воздушные пузырьки. Вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы. Убедитесь, что игла тех пор, и конические, насколько возможно (рис. 2а). Если игла слишком тупой, он не сможет проникнуть через эктодермы и не сможет проникнуть в судно. Если игла слишком острым, кончик рухнет, когда проникающая ткани.
  2. Внутривенно вводят по 100 мкл 1 мг / мл флуоресцеина декстрана (70000 МВт Да, Invitrogen) в опухоли эмбриона подшипников дистальнее нужный сайт для визуализации (рис. 3). Успешная катетеризация вены CAM видно по очистке крови в пути инъекции потока (рис. 2б). Оценка сосудистой утечки через 1 час после инъекции.
  3. Внутривенно вводят 50 мкл 1 мг / мл раствора CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) или пегилированного CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-ПЭГ-AF 647) в эмбрионы содержащие опухоли с сосудистой утечки дистальных от желаемого сайта быть визуализированы.
  4. Изображение опухоли сразу и каждый час после инъекции использованием Zeiss Ревизора Z1 прямой микроскоп оснащен диском Yokogawa спиннинг, Хамамацу ImagEM 9100-12 EM-CCD камерой.

4. В реальном времени прижизненной визуализации

  1. Чтобы собрать блок эмбриона изображений, нанесите тонкий слой вакуумной смазки по окружности изображений порта на нижней крышке устройства визуализации эмбриона, и соответствовать 18 мм стекло покровное на порт.
  2. Позиция эмбриона, что покровное будет охватывать требуемую область для работы с изображениями. Медленно опустите крышку, пока покровное просто вступает в контакт с эмбриона, а затем винтовой крышкой на единицу, чтобы удерживать его на месте (рис. 2).
  3. Добавить воды, нагретой до 37 ° С в блок визуализации эмбриона вне блюдо с эмбриона, а затем поместить весь блок на сцену вертикально конфокальной микроскопии с внутренней экологической камеры доведены до 37 ° C.
  4. Установите копи содержащие эмбриона под вращающийся диск конфокальной микроскопии флуоресценции (рис. 2е). Копи проведет эмбриона на месте и держать в поле зрения фиксированной во время захвата изображения, позволяющий как для трехмерных стеков Z и покадровой изображения, которые будут захвачены в плен. Мы приобретаем и анализа трехмерных покадровой изображения с помощью Перкин Элмер (ранее импровизация) Volocity пакет программного обеспечения (рис. 3а). Приобретать высоким разрешением трехмерные стопки опухоли и окружающих сосудистой визуализировать detaileг структурного анализа в определенных временных точках. Приобретать трехмерных стеков в основное время, указывает на карте подробные структурные изменения в сосудистую сеть опухоли. Изображение опухоли каждый час после инъекции.
  5. Количественного поглощения вирусных наночастиц рассчитать среднее Alexa Fluor (AF) 647 сигнала в отдельных регионах в опухоли или в строме (неопухолевой область) с использованием образа программного обеспечения, таких как количественный Volocity (Perkin Elmer). Опухоли стромы соотношение было рассчитывается путем деления средней AF 647 сигнал в опухоли на длине AF 647 сигналов в строму. Опухоль / стромы соотношение выше, чем 1 указывает, что наночастицы, рассматриваемых опухоли.

5. Представитель результаты:

В примере, описанном здесь, мы вводили HT-29 клетки рака толстой кишки в форме болюса примерно 1 мм размера в течение CAM дня 9 куриных эмбрионов (рис. 1b). После прививки, эмбрионы культивировали в течение 7 дней в увлажненном инкубаторе разрешить достаточный рост опухоли и васкуляризации (рис. 1в). Эмбрионы вводили внутривенно с низким молекулярным весом декстран для подтверждения васкуляризации опухоли и опухоли были визуализированы под Zeiss AxioExaminer Z1 прямой микроскоп (рис. 2г).

После внутривенного введения CPMV-AF 647 или CPMV-ПЭГ-AF 647 наночастиц (рис. 3а, б) высокого разрешения в режиме реального времени конфокальной микроскопии (рис. 2е) показало, что оба CPMV и CPMV-ПЭГ наночастицы быстро помечены всей сосудистой сети, но поглощение CPMV-ПЭГ на опухоль была примерно в 3 раза выше, чем CPMV после 12 часов (рис. 3а). Относительное поглощение наночастиц опухоли определяли с помощью анализа изображений программное обеспечение (Volocity от Perkin Elmer). Интересующие регионы были выбраны в пределах и за пределами опухоли (в стромальных ящиком) и средняя интенсивность флуоресценции каждого был определен. Данные выражается как опухоль / стромы отношение.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Микроинъекция опухолей в CAM от птичьего эмбриона. () Микроинъекции аппарат собирается из компонентов, как указано. (Б) Птичий эмбрионов на 9-й день готовы к засевают опухоли, когда CAM распространился, чтобы покрыть всю поверхность. (С) На 16-й день, опухоль вырастет до до 1 см в диаметре (пунктирная линия) и готов к инъекции наночастиц.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Инъекции наночастиц и прижизненной визуализации. Инъекция под рассечение микроскопа () кончик иглы microinjector готовы быть введен в вену CAM и (б) иглы microinjector вставляется в вену (указано стрелкой) и наночастиц вводят в кровоток (если смотреть в безналичном крови). (С) изображений единица, содержащая птичьего эмбриона с покровным сопряжены непосредственно с CAM. (Г) До наночастиц инъекции, васкуляризация опухоли оценивается с помощью прижизненного изображения после введения флуоресцеина декстран. (Е) изображений единица, содержащая эмбрион расположен на этапе вертикально конфокальной микроскопии в пределах температуры регулируемой набора корпуса до 37 ° C.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Прижизненное визуализации наночастиц в опухолях человека. Опухоли визуализируются 7 часов после инъекции () CPMV-AF647 и (б) CPMV-ПЭГ-AF647. г) Иссечение опухоли от птичьего эмбриона для последующего анализа.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chorioallantoic мембраны (CAM) от птичьего эмбриона полезной модели для оценки динамики и сосудистой фармакокинетику опухолей человека. Структура и положение CAM позволяет с высокой приобретение качество изображения и вмещает многих видов рака ксенотрансплантаты без инвазивных хирургических процедур. Более того, ксенотрансплантаты раковой опухоли имплантируются в chorioallantoic мембраны стать васкуляризированной в течение 7 дней, предлагая быстрый, недорогой и полуфабрикатов высокой пропускной средства для оценки накопления наночастиц в опухолевой ткани. Поскольку раковые ксенотрансплантаты имплантированы в CAM оболочки менее куриные эмбрионы были доступны для высокого разрешения оптики вертикально epifluorescence или конфокальной микроскопии, контекстная и временной информации о наночастиц в сосудистую сеть опухоли могут быть легко получены. Рак ксенотрансплантаты в этой модели, как правило, растут с боков через CAM, что приводит к опухоли, которые являются большими, оставаясь при этом менее 200 м в глубину. Это делает их особенно хорошо подходит для прижизненной визуализации потому что стандартные epifluorescence микроскопы могут эффективно проникать всю массу опухоли. В отличие от опухолей, имплантированных в любом поверхностными или ортотопической сайтов внутри мыши размножаются в трех измерениях, что делает ее трудно точно локализовать наночастиц глубоко внутри этих опухолей путем неинвазивных методов. Мы использовали эту модель для оценки поглощения квантовых точек, липосомы и наночастицы оксида железа в число человеческих ксенотрансплантаты опухоли, подчеркивает потенциал для этой модели, чтобы служить для в естественных условиях анализ широкого спектра наночастицы формулировки.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано CCSRI Грант № 700537 и CIHR Грант № 84535 на ЛЗЕ и NIH / NCI грант № CA120711-01A1 и 01A1-CA120711 на AZ. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и руководящими принципами институциональной уходу и использованию животных комитета в Университете Калифорнии в Сан-Диего, уходу за животными и использование в Университете Западного Онтарио.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагент Имя / Оборудование Компания Номер по каталогу Комментарии
Оплодотворенные яйца леггорн Фрей `ы рыбоводного завода, г. Санкт-Якобс N / A
Ротационный инструмент Dremel Dremel Может использоваться любой модели
Dremel отсечки колес нет. 36 Dremel 409
Спортсмен выводном Берри Хилл 1550HA
Спортсмен инкубатор Берри Хилл 1502EA
Этанол 70% (об / об)
Полистирол вес лодки VWR 12577-01
Площадь чашки Петри Simport, VWR 25378-115
Rubbermaid резиновый контейнер с крышкой Guillevin RH3-228-00-BLU отверстия, просверленные в стороны
Вертикальная пипетки съемник Дэвид Kopf инструменты Модель 720 Настройки: 16.3 (обогреватель) и 2.3 (соленоид)

Натриевоборосиликатных стеклянные капилляры

Саттер Инструмент BF100-58-10

(Внешний диаметр 1,0 мм; ID 0,58 мм, 10 см

длина)
1X Дульбеко изменения Eagle Средняя (DMEM) Invitrogen 11995073
Дульбеко Invitrogen 14190250 рН 7,4
Фосфатно-солевом буфере (D-би-эс) (1X), жидких
Трипсин, 0,05% (1X) с ЭДТА 4Na, жидких Invitrogen 25300054
Эмбриональной телячьей сыворотки Invitrogen 12483-020 Тепло инактивировать
Гемоцитометра Хауссер Научные, VWR 15170-090
Центрифуга Эппендорф модель 5810R 5811 000.010
Тонкая точки щипцы VWR 25607-856
Tygon R-3603 трубы VWR 63009-983 50 футов (1/32-inch внутренний диаметр, 3/32-inch наружный диаметр, толщина стенки 1/32-inch
Подкожные иглы для инъекций 18-иглы BD 305195 Комплект из 100
1 мл шприцев для инъекций BD 309602 Комплект из 100
Волоконно-оптический микроскоп осветитель Amscope HL250-AY 150W
kimwipes VWR 10805-905
В. unguiculata семян (Калифорния черный глаз нет. 5) Берпи 51771A
Крытый огни роста SunLite, поставка садовника
Метил-PEO4-NHS эфир Проколоть PI22341
MPEG-NHS, ПЭГ сукцинимидил эфир, МВт 2000 NANOCS PEG1-0002
Alexa Fluor 647 карбоновой кислоты (сукцинимидил эфир) Invitrogen A20006
Орегон Зеленый 488 сукцинимидил эфир * 6-изомера * Invitrogen O-6149
Диметилсульфоксид (ДМСО) Сигма D8418
Диаммоний фосфат monohydrogen Сигма 379980 К2НРО4 (для буфера phopshate)
Монокальцийфосфат дигидрофосфат P5655 КН2РО4 (для буфера phopshate)
Superose 6 гель-колонки GE Healthcare наук о жизни 17-0673-01
Akta Проводник 100 Хроматограф GE Amersham Pharmacia WS-AKTA100
Akta высокой комплект поток GE Healthcare наук о жизни 18-1154-85
Сахароза Сигма S0389
Ультрацентрифуге Бекман
SW 28 Ti ротора Бекман 342204 Свинг ведро
50,2 Ti ротора Бекман 337901 Фиксированный угол
Amicon Ультра-15 центробежный фильтр единиц Millipore UFC910008 100 кДа отрезать
Градиент бывшего Biorad
декстран, флуоресцеин, 70000 МВт, анионные Invitrogen D1823
Вращающийся диск конфокальной микроскопии флуоресценции Кворум; Yokogawa
CSU 10, Yokogawa 		N / A
Epifluorescence широким полем зрения микроскопа Кворум; Zeiss Axio Examiner, Zeiss N / A
Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD камера Кворум; Хамамацу N / A
Температура корпуса блок для микроскопа Точность пластмассы N / A
Вакуумная смазка VWR 59344-055
Циркуляр стекла покровные нет. 1 (18 мм) VWR 16004-300
Volocity программного обеспечения Перкин Элмер
Куриного эмбриона корпус пользовательские сфабрикованы
Нежный ножницы VWR 25608-203
Формалин Bioshop FOR201.500 Использование в fumehood
Оптимального раскроя Фишер; Ткань Tek 1437365
Температура (ОКТ)
Пластиковые формы Рыболов 22-038217
VWR VistaVision HistoBond клей Слайды VWR 16004-406
Продлите золота с DAPI Invitrogen P36931
Одноразовые лезвия для криостата Рыболов 12-634-2
Криостат Leica CM 3050 S 14047033518

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
  2. Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
  5. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  6. Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
  7. Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
  8. Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
  9. Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
  10. Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
  11. Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
  12. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , Forthcoming (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи