Это исследование описывает диагностики птичьего гриппа у диких птиц с помощью портативного-ПЦР системы. Метод использует лиофилизированной реагентов для скрининга диких птиц в не лабораторных условиях, характерных для вспышки сценарию. Использование молекулярных инструментов обеспечивает точные и чувствительные альтернатив для экспресс-диагностики.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экспресс-диагностики вируса птичьего гриппа у диких птиц: Использование портативных-ПЦР и сублимированные реагенты в поле
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дикие птицы вовлечены в распространение высокопатогенного гриппа птиц (HPAI) подтипа H5N1, что обуславливает необходимость эпизоонозологического надзора вдоль миграционных путей. Отбор проб у диких птиц для выявления вируса гриппа птиц (AIV) часто проводится в отдаленных регионах, однако получение результатов нередко задерживается из-за необходимости транспортировки образцов в лабораторию, оснащенную для проведения молекулярного тестирования. Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией в реальном времени (rRT-PCR) представляет собой молекулярный метод, который является одним из наиболее точных и чувствительных способов диагностики AIV. Строгие лабораторные протоколы, ранее требовавшиеся для rRT-PCR, в настоящее время адаптируются для применения в полевых условиях. Разработка лиофилизированных реагентов, не требующих соблюдения холодовой цепи и обладающих чувствительностью на уровне жидких реагентов, сделала проведение тестирования на месте в отдаленных районах практически достижимой целью.
В данной работе мы представляем метод экспресс-диагностики вируса гриппа птиц (AIV) у диких птиц с использованием устройства для рРТ-ПЦР (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device или RAPID, Idaho Technologies, Солт-Лейк-Сити, Юта), в котором применяются лиофилизированные реагенты (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). Реагенты содержат все необходимые для анализа компоненты в соответствующих концентрациях в одной пробирке: праймеры, зонды, ферменты, буферы и внутренние положительные контроли, что исключает ошибки, связанные с неправильным хранением или обращением с жидкими реагентами. Портативное устройство проводит скрининг на грипп А путем анализа матриксного гена и выдает результаты через 2-3 часа. Также возможно генетическое субтипирование с использованием наборов праймеров H5 и H7, нацеленных на ген гемагглютинина.
Данная система подходит для анализа клоакальных и орофарингеальных проб, отобранных у диких птиц, что продемонстрировано здесь на примере мигрирующего кулика — малого западного песочника (Calidrus mauri), отловленного в Северной Калифорнии. Обращение с животными проводилось в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Западного центра экологических исследований Геологической службы США, и разрешениями Лаборатории кольцевания птиц Геологической службы США. Основным преимуществом этого метода является ускорение диагностики диких птиц, что повышает шансы на локализацию вспышки заболевания в отдаленных районах. Диагностика на месте также окажется полезной для идентификации и изучения инфицированных особей в диких популяциях. Возможность сбора данных о биологии хозяина (иммунологической и физиологической реакции на инфекцию) и пространственной экологии (миграционных показателях инфицированных птиц) позволит понять, в какой степени дикие птицы могут выступать в качестве переносчиков AIV на большие расстояния.
Протокол
1. Дикие птицы захвата использованием тумана сетей
- Для захвата shorebird, создать туман сети на активную нагула сайт, например, болото, береговой линии, или грязь квартиры.
- Слайд мережа линии петли один конец тумана сеть вокруг полюса и полюса вставить вертикально в грязи.
- Протяни сети, вставить второй полюс через петли мережа на другом конце сети и тумана вертикально вставить полюс в грязь, убедившись, что мережа линии учат.
- Как только птица в плен, экстракт птица из сети и вернуться в полосы станции.
2. Клоаки тампоном выборки
- Сбор мазки из клоаки сразу после съемки
- Найдите клоаки и использование пальцев отодвинуть окружающие перья
- Unwrap стерильной дакрона или полиэстер наконечником тампоном, стволовые конце первого, и смочить кончик стерильным вирусных транспортное средство для большего удобства в моечные. После увлажнения, вся глава тампоном аккуратно вставляется в клоаку. Тампон внутренней окружности клоаки Медленно крутит тампоном и удалите тампон из клоаки.
- Вставка кончик тампона непосредственно в вирусную флаконе транспортной образцов носителей; вращать тампон вал между большим и указательным пальцами в то время как тампон в средствах массовой информации. Попросите помощника завершить процедуру, потянув за кончик тампона назад со дна флакона ~ 1 см и разрезать вал тампоном с ножницами так кончик тампона остается в пузырек и вал не мешает крышка закрытия. Закрыть сосуд крышкой плотно. Лечить ножницы с алкоголем в тампоном между режущими валами.
- Место флаконов в морозильной камере коробку или сухого льда или пакеты со льдом.
3. Ротоглотки выборки тампоном
- Аккуратно откройте клюв птицы так, чтобы хоан щель видна
- Берем чистый тампон из упаковки, стволовые конце первого, и смочить наконечник с вирусными транспортное средство для большего удобства в моечные
- Не касаясь кончиком к любой другой поверхности, вставьте его в рот и тампоном хоан отверстие на верхней челюсти и продолжают назад к ротоглотки или гортани регионе
- Поместите кончик тампона непосредственно в вирусную флаконе транспортной среды. Поворот тампоном вал между большим и указательным пальцами в то время как тампон в средствах массовой информации. Как и выше, у помощника вытащить кончик тампона назад со дна флакона ~ 1 см и разрезать вал тампоном с ножницами так кончик тампона остается в пузырек и вал не мешает с крышкой закрытия. Закрыть сосуд крышкой плотно. Лечить ножницы с алкоголем в тампоном между режущими валами.
- Место флаконов в морозильной камере коробку с сухим льдом или пакеты со льдом.
4. Обработке птицы и выпуска
- Вернуться птиц к месту захвата и освобождения своевременно (<20 минут). Обработчики должны знать принципы защиты животных и быть начеку на признаки птицы страдания во время отбора проб (то есть ссадины, миопатии, гипо-или гипертермия). Основные аптечка должна быть включена в перечень экипировки.
5. Тестирование объектов
- Образцы могут быть проверены в любом закрытом пространстве, например, прицепа исследований или палатке, с блоком питания (напряжение регулируемой мощности генератора), чтобы запустить блок ПЦР и придает компьютеру.
6. Выделения РНК
- Выделения РНК проводили с RNeasy Мини комплект с незначительными изменениями, инструкции изготовителя следующие Спакман и др. 1.
- Vortex среду тампоном в течение 3-5 с и передачи 350 мкл до 2 мл микроцентрифужных трубки. Примечание: Следует остальные образцы на льду в случае ПЦР-положительных образцов должны быть rescreened или H5 тест должен быть запущен.
- Добавить 350 мкл буфера RLT (с β-я) и вихревые течение 5 с
- Добавить 350 мкл РНК классе 70% этанола.
- Центрифуга на 5000 мкг в течение 5 мин.
- Добавить 600 мкл надосадочной чтобы спина колонке помещены в 2 мл пробирки. Сохраните оставшиеся образца в испытательный стенд трубки.
- Центрифуга в течение 20 с на высоте 10000 мкг и отбросить проточные.
- Повторите шаги 17-18, пока все образец был принят в форме выделения колонки.
- Место спин колонки в 2 мл чистой трубки коллекции.
- Добавить 700 мкл буфера для RW1 спина колонны и центрифуги 25 с при 10000 х g. Отменить проточные.
- Добавить 500 мкл буфера ПЭС в колонну спина и центрифуги в течение 25 с при 10000 х g. Отменить проточные.
- Повторите шаг 22 для в общей сложности два промывок НПП буфера.
- Центрифуга спин колонки для дополнительных 2 минут при 14000 х g. Отменить сбор трубки.
- Место спин колонки в чистые 1,5 трубки микроцентрифужных мл и добавляют 50 мкл нуклеазы без воды. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 с
- Элюции РНК, крутя в течение 60 с на высоте 10000 XGFили 60 с Место очищенные образцы на льду.
7. Подготовка отрицательного контроля
- Лиофилизированный реагентов были подготовлены для использования в ПЦР в соответствии с инструкциями из лиофилизированной Айдахо Технологии Kit Обнаружение Реагент для TaqMan зонды гриппа Задача 1 (Асей-ASY-0109).
- Центрифуга отрицательные флакон реагента контроля (красный) в течение 3 с для обеспечения гранулы в нижней части.
- Снять крышку, визуально убедиться, что гранулы в нижней части.
- Добавьте 20 мкл буфера 2 X Восстановление и 20 мкл воды класса реагентов.
- Отчет и вихревые в течение 5 с при максимальной скорости.
- Центрифуга в течение 3 с, чтобы принести жидкости на дно флакона.
- Визуально проверьте гранул имеет регидратации, если не повторить шаги 31-32.
- Внесите 19 мкл гидратированных смесь в LightCycler капиллярная трубка, повторите шаг пипетки во вторую капиллярную получить дубликат.
8. Подготовка тестовых образцов
- Центрифуга неизвестные флакон реагента (синий) на 3 секунды, чтобы обеспечить гранулы в нижней части.
- Снять крышку, визуально убедиться, что гранулы в нижней части.
- Добавить 40 мкл очищенной РНК.
- Отчет и вихревые в течение 5 с при максимальной скорости.
- Центрифуга в течение 3 с, чтобы принести жидкости на дно флакона.
- Визуально проверьте гранул имеет регидратации, если не повторить шаги 38-39.
- Внесите 19 мкл гидратированных смесь в LightCycler капиллярная трубка, повторите шаг пипетки во вторую капиллярную получить дубликат.
9. Подготовка положительного контроля
- Центрифуга положительные флакон реагента контроля (зеленый) в течение 3 с для обеспечения гранулы в нижней части.
- Снять крышку, визуально убедиться, что гранулы в нижней части.
- Добавьте 20 мкл буфера 2 X Восстановление и 20 мкл воды класса реагентов.
- Отчет и вихревые в течение 5 с при максимальной скорости.
- Центрифуга в течение 3 с, чтобы принести жидкости на дно флакона.
- Визуально проверьте гранул имеет регидратации, если не повторить шаги 45-46.
- Внесите 19 мкл гидратированных смесь в LightCycler капиллярная трубка, повторите шаг пипетки во вторую капиллярную получить дубликат.
10. Центрифугирование капилляров
- Как только все капиллярные трубы для партии были подготовлены загружать их в мини-центрифуга оснащена капиллярной адаптеров.
- Центрифуга на минимальное значение, удерживая нажатой кнопку пульс в течение 1 сек Это переводов жидкости на дно в рамках подготовки к тестированию.
11. Операционная RAPID
- Создать новый файл. Этикетка положительного контроля, отрицательного контроля и образцов (по их идентификационный номер).
- Программа 1: Подготовка образцов РНК Удерживайте
- Циклы = 1
- Анализ Режим = Нет
- Целевая температура = 40
- Инкубационный Время = 30 мин
- Оценить температуру перехода = 20 ° С / с (по умолчанию)
- Вторичная целевая температура = 0 (по умолчанию)
- Шаг Размер = 0 (по умолчанию)
- Шаг Delay = 0 (по умолчанию)
- Приобретение Mode = Нет (по умолчанию)
- Программа 2: РНК Денатурация
- Циклы = 1
- Анализ Режим = Нет
- Целевая температура = 94
- Инкубационный Время = 120 с
- Оценить температуру перехода = 20 ° С / с (по умолчанию)
- Вторичная целевая температура = 0 (по умолчанию)
- Шаг Размер = 0 (по умолчанию)
- Шаг Delay = 0 (по умолчанию)
- Приобретение Mode = Нет (по умолчанию)
- Программа 3: Усиление РНК
- Циклы = 45
- Анализ Mode = Auto Анализ
- Целевая температура, Сегмент 1 = 94; Сегмент 2 = 60
- Инкубационный период, Сегмент 1 = 0 с, Сегмент 2 = 20 с
- Температура перехода Rate, Seg 1 & 2 = 20 ° С / с (по умолчанию)
- Вторичные Целевая температура, Seg 1 & 2 = 0 (по умолчанию)
- Шаг Размер, Seg 1 & 2 = 0 (по умолчанию)
- Шаг Delay, Seg 1 & 2 = 0 (по умолчанию)
- Приобретение режиме Сегмент 1 = нет; Сегмент 2 = один
- Параметры флуоресценции
- Режим отображения: флуоресценция канал 2 (канал 2 / 1)
Доходы:- Ч. 1 (F1) = 1
- Ч. 2 (F2) = 8
- Ч. 3 (F3) = 1
- Для отображения в режиме реального времени флуоресценции данных для каждого образца, выберите образец интерес и нажмите кнопку "Показать график" в нижней части экрана
- Режим отображения: флуоресценция канал 2 (канал 2 / 1)
- Для каждого капилляра, результаты включают в себя следующее:
- # - Определяет положение карусель карусель
- Пример имя - предоставляет имя образца
- Контроль - идентифицирует тип пробы для каждого образца
- Оценка - рассчитывается с использованием отношения между флуоресценции образца и уровень фоновой флуоресценции в образце
- Результат - отображает общий результат для образца
12. Представитель результаты:
Присутствовали: "настоящее" вызов красный для испытаний и / или неизвестных образцов показывает, что цель была выявлена в том, что пробы и контроля были успешными.Не обнаружено: "не обнаружен" назвать зеленым испытаний и / или неизвестных образцов показывает, что цель не была, определенных в этом образце и тест контроля были успешными.
Пожалуйста, повторите: "пожалуйста, повторите 'показывает, что положительный или отрицательный контроль не удалось.
Примером успешного анализа RAPID 7200 показана на рисунке 4. Положительный контроль усиливается и создает обнаружить флуоресценции (оси ординат) примерно 25 циклов (оси Х). Цикл порог (КТ)> 35, согласились отсечки для большинства лабораторий ВГП, ссылки. Таким образом, положительного контроля для этого метода производится флуоресцентного сигнала в рамках принятой число циклов (0-35) для обнаружения ВГП. В отличие от отрицательного контроля не генерирует флуоресцентный сигнал, даже после 45 циклов. Кроме того, двенадцать образцов, взятых из западных куликов не генерировать флуоресцентный сигнал о том, что птицы были отрицательными для AIV. Последующие испытания всех положительных проб в традиционной лаборатории рекомендуется обеспечить, чтобы без ложных срабатываний ошибочно производится.
Рисунок 1. Shorebird захвата использованием тумана сетей.
Рисунок 2. Сборник клоаки и ротоглотки образцы из наименее куликов.
Рисунок 3. Программирование RAPID 7200 для амплификации РНК.
Рисунок 4. Флюорограмма порожденных RAPID 7200 портативный-ПЦР, показывающие, как положительный и отрицательный контроль должен появиться в успешной анализа. Щелкните здесь для просмотра полного размера изображения
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод экспресс-диагностики, представленные здесь облегчает эффективный по времени и точное тестирование образцов диких птиц для наблюдения ВГП. Гораздо менее строгие требования к хранению образцов переносного-ПЦР подходят для удаленных ситуациях, когда поддержание холодовой цепи может оказаться нецелесообразным, если жидкость грузоотправителей азота или сухого льда не доступен. Кроме того, мы обнаружили, что анализ образцов с лиофилизированной реагентов был достаточно простым, чтобы быть выполнена поле биологи с минимал...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить М. Скаллион и Р. Крисп Айдахо технологии для технической поддержки и USGS западных экологических исследований Центра финансирования (С. Шварцбах) и помощь (К. Spragens, Т. Грэм). Это исследование проводилось под эгидой Центра инновационных технологий - Институт по вопросам обороны и Национальная Безопаность (www.idhs.org), в поддержке Министерства обороны и Исследовательская лаборатория ВВС. Животное обработки протоколов следуют утвержденным уходу и использованию животных комитета Геологической службы США Западная экологический центр исследований и разрешения американского Геологического Обзора кольцевание птиц лаборатории. Любое использование торговых, продуктов и фирменных наименований в данной публикации, в описательных целях и не подразумевает одобрения правительства США.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии (необязательно) |
| RNeasy спина мини-колонки | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
| Коллекция трубок (1,5 и 2 мл) | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
| Буфера RLT | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
| Буфер RW1 | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
| Буфер НПП | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
| РНКазы без воды | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
| 14,3 M β-меркаптоэтанол решение | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% этаноле | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Genie Vortex 2, 120В | Научно Industries | SI-0236 | |
| Taqman гриппа Задача 1 (гидролиз Probe) | Айдахо Технологии | Асей-ASY-0109 | |
| LightCycler 20мл капилляров | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Микро-центрифуга с ротатором для 2 мл пробирок | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID | |
| Повышенной прочности Расширенный Возбудитель идентификации устройства (РАПИД) 7200 | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID | |
| Pentium основе ноутбука с Windows XP Professional | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID | |
| LightCycler Анализ данных программного обеспечения | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID |
Ссылки
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
