Метод включения плазмидной ДНК в мышиных клеток сетчатки для целей осуществления любой выигрыш или потеря функции исследования В естественных условиях Представлена. Этот метод капитализирует на кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран плазмы индуцированных применением внешнего электрического поля.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных условиях Электропорация развивающихся Мышь Retina
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Функциональная характеристика генов, экспрессируемых в процессе развития сетчатки млекопитающих, по-прежнему представляет собой сложную задачу. Таргетный мутагенез для создания конститутивных или условных нокаутов с потерей функции остается дорогостоящим, трудоемким и длительным процессом. В дополнение к этим трудностям гены, экспрессируемые в сетчатке, могут выполнять важные функции и в других тканях, что при использовании подхода с нокаутом может привести к непреднамеренным побочным эффектам. Более того, возможность эктопической экспрессии гена в экспериментах по усилению функции может быть чрезвычайно ценной при попытке определить его роль в спецификации клеточной судьбы и/или терминальной дифференцировке.
Мы представляем метод быстрого и эффективного введения плазмид ДНК в сетчатку глаза новорожденной мыши с помощью электропорации. Применение коротких электрических импульсов определенной напряженности приводит к временному увеличению проницаемости плазматической мембраны, что способствует переносу материала через мембрану 1,2,3,4. Основополагающие исследования показали, что электропорация может быть использована как метод переноса генов в клетки млекопитающих путем индуцирования образования гидрофильных пор в плазматической мембране, что обеспечивает прохождение сильно заряженной ДНК через липидный бислой 5. Постоянное техническое развитие позволило использовать электропорацию в качестве метода переноса генов in vivo в различных тканях мыши, включая сетчатку; данный метод описан в настоящей работе 6, 7, 8, 9, 10.
Раствор ДНК вводится в субретинальное пространство таким образом, чтобы ДНК располагалась между ретинальным пигментным эпителием и сетчаткой новорожденной (P0) мыши, после чего с помощью электрода-пинцета подаются электрические импульсы. Латеральное расположение глаз у мыши позволяет легко ориентировать электрод-пинцет для создания необходимого выравнивания по оси: отрицательный полюс — ДНК — сетчатка — положительный полюс. Обширная инкорпорация и экспрессия перенесенных генов могут быть выявлены ко 2-му постунатальному дню (P2). Из-за отсутствия значимой латеральной миграции клеток в сетчатке образуются электропорированные и неэлектропорированные области. Неэлектропорированные области могут служить внутренним гистологическим контролем в соответствующих случаях.
Электропорация сетчатки может быть использована для экспрессии гена под действием универсального промотора, такого как CAG, или для нарушения функции гена с помощью конструкций shRNA или Cre-рекомбиназы. Более таргетная экспрессия может быть достигнута путем разработки конструкций с клеточно-специфичными промоторами генов. Визуализация электропорированных клеток осуществляется с использованием бицистронных конструкций, экспрессирующих GFP, или путем совместной электропорации конструкции для экспрессии GFP. Кроме того, для изучения комбинаторных эффектов генов или одновременного усиления и подавления функций различных генов могут быть электропорированы несколько конструкций. Электропорация сетчатки также может применяться для анализа геномных цис-регуляторных элементов путем создания соответствующих экспрессионных конструкций и делеционных мутантов. Такие эксперименты могут быть использованы для идентификации цис-регуляторных областей, достаточных или необходимых для клеточно-специфичной экспрессии генов 11. Потенциальные эксперименты ограничены только доступностью соответствующих конструкций.
Протокол
1. Плазмиды подготовки к электропорации
Концентрации ДНК, необходимые для электропорации является 5μg/μl. Обычно для этого требуется, чтобы желаемое плазмид быть усилен использованием Maxi-приготовительные (Qiagen) или эквивалентного метода последующей очистки и концентрации ДНК, чтобы рабочий объем. Следующие шаги описывают подготовки ДНК, чтобы рабочий объем.
- Алиготе 100 мкг ДНК (от Maxi-приготовительные или эквивалент) и разбавленных объема до 100 мкл для удобства манипулирования.
- Добавить фенола; количество фенола следует рассчитывать получить около 60% ДНК / объему (мкг ДНК: общий объем), т.е.: 100 мкг ДНК (в 100 мкл) плюс 67 мкл фенола (100 мкг: 167 мкл). Тщательно перемешать, не пипетку вверх и вниз, так как это может привести к чрезмерной стрижка ДНК.
- Спиновые ДНК в течение 5 минут при 14000 оборотов при комнатной температуре.
- Сбор супернатант и добавить хлороформ, используя тот же ДНК: соотношение общего объема в шаге 1.2; смеси, как описано в пункте 1.2 и вращаются на 14000 RPM в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Сбор супернатант, добавить 10% супернатанта объемом 3 М ацетата натрия на раствор ДНК, аккуратно перемешать и добавить 2,5 X супернатанта объемом 100% этанола. Смешайте по инверсии. ДНК должна выпадают из раствора в процессе перемешивания.
- Спиновые ДНК при температуре 4 ° С в течение 10 минут при 14000 оборотов в минуту.
- Промыть 350 мкл 70% этанола, вращаются на 14000 RPM в течение 5 минут при 4 ° C.
- Воздух сухой осадок затем растворить ДНК в 1 X PBS (степень Клеточная биология) для 5μg/μL. Не пересушивать образца, так как это делают его очень трудно растворяются в PBS.
- Добавить Быстрый краситель зеленый (10% акций), чтобы раствор ДНК, конечной концентрации красителя 0,1%, в качестве инъекций индикатора.
2. Субретинальной инъекции ДНК
Следующие шаги выполняются с помощью стереомикроскопа. После практикуется процесс открытия глаз, разрез, и инъекции занимает не более 1,5 минут, что не успевает должным образом наркозом щенка, чтобы оправиться. Используя острый 30-иглы, осторожно откройте глаза разрезанием вдоль плавленого соединительного эпителия (рис. 1в). Не прикладывайте чрезмерных усилий, поскольку это может привести к резкой основной глаза. Избегайте резки за пределы века стык, поскольку это приведет к кровотечение, которое может скрыть инъекции.
- Обезболивания новорожденных мышей на льду в течение нескольких минут (рис. 1А), не хоронят щенков в лед, поскольку это может привести к смерти. Времени на льду переменную из щенка к щенку, как правило, 5 минут достаточно, но мышей необходимо тщательно контролировать, как люди могут реагировать очень быстро и могут потребовать более длительного воздействия для обеспечения надлежащей анестезии. Поведение лапу шнура с hemostats для проверки вывода рефлекс.
- Для того чтобы облегчить введение ДНК субретинальной пространство глаза сначала должен быть открыт. Тампон глаз, который будет введен с 70% изопропиловый спирт приготовительные (Tyco Healthcare) и определить плавленого соединительного эпителия, где два веки собрались вместе (рис. 1В).
- Используя острый 30-иглы, осторожно откройте глаза разрезанием вдоль плавленого соединительного эпителия (рис. 1в). Не прикладывайте чрезмерных усилий, поскольку это может привести к резкой основной глаза. Избегайте резки за пределы века стык, поскольку это приведет к кровотечение, которое может скрыть инъекции.
- Для облегчения проникновения глаз тупыми концами инъекционной иглой использовать кончик 30-guage иглой делают небольшой разрез в склере недалеко от перекрестка с роговицы (рис. 1E). Не проникает слишком глубоко, как это может привести к проколу линзы.
- Нарисуйте 0,3 мкл раствора ДНК в 33 калибр тупыми концами инъекционной иглой шприца использованием градиентов для измерения объема индивидуально для каждой инъекции (игла наружным диаметром 0,52 мм, внутренний диаметр 0,13 мм; Exmire микрошприца; Ито корпорации). Вставьте иглу в разрез, пока сопротивление противоположной стене склеры ощущается. Будьте осторожны, чтобы избежать проникновения линзы, как игла прошла через vitreal камеры (рис. 2б).
- Медленно вводят 0,3 мкл раствора ДНК в субретинальной пространстве, используя указательный палец или большой палец, чтобы угнетать поршень шприца. Экспериментатор должен быть осторожным, чтобы контролировать скорость депрессии поршень так, что скорость, с которой раствор ДНК вводится в субретинальной пространство не опережать скорость, с которой ДНК решение распространяется в субретинальной пространства (рис. 2). ДНК решение вязкой, поэтому важно, чтобы игла не нажата слишком сильно против противоположных склеры стены, как это может привести к ДНК не вводили и не распространяется равномерно. Успешное введение приведет к ещеРаспространение ДНК решение в части субретинальной пространства. Регионы сетчатки и без основного зеленого трассирующими должны быть очевидны при повороте вводили животным.
3. Электропорация
- Электропорация осуществляется с помощью 10 мм в диаметре пинцет электрод (модель # 522; BTX Instruments). Замочите пинцет электрода в ФБР, чтобы максимизировать электропроводности от электрода к животным и место главы вводят щенка между электродами с глазу вводят прилегающих к положительному электроду полюса и неинъекционные глаз, прилегающих к отрицательному полюсу электрод (рис. 3б).
- Применить пяти квадратных импульсов использованием генератора импульсов: каждый импульс на 80 вольт и 50 миллисекунд по продолжительности с 950 миллисекунд интервал между импульсами.
- Электропорации щенки должны теперь быть прогреты, пока они не оправиться от льда анестезии. Это может быть сделано путем размещения щенков под потепления лампы или на верхней части слайда теплее. При использовании слайд теплее обеспечить соответствующую площадку помещается между поверхностью металла и восстановление щенка. После восстановления возвращения электропорации щенков к матери.
4. Подготовка глаз для анализа
- Время сбора и анализа электропорации сетчатки производится при условии целей эксперимента. GFP выражение может быть грубо визуализируется через 3 дня после электропорации. Для cryoembedding и секционирования поступить следующим образом.
- Жертва электропорации животных в нужном timepoint. Disect из электропорации глаз и зафиксировать в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение 50 минут.
- Осторожно снимите сетчатку от глаз, микро-рассечение от склеры, роговицы, хрусталика, сосудистой оболочки и сетчатки пигментный эпителий. Расчлененный сетчатки могут быть проанализированы при флуоресценции грубо определить эффективность электропорации. Передача сетчатки до 30% раствором сахарозы течение ночи при 4 ° C.
- Замораживание сетчатки в октябре крио-вложение средств массовой информации (Sakura Finetek США) и хранят при температуре -80 ° C. Сетчатки может теперь быть подразделяются на замораживающий микротом и захватили на стеклах.
5. Представитель Результаты:
Примеры P0 новорожденных сетчатки электропорации с pCAG-EGFP плазмиды экспрессии представлены в 3 дней после электропорации (P3) и 14 дней после электропорации (P14) на рисунке 4. Площадь ткани сетчатки электропорации переменная от эксперимента к эксперименту в зависимости от степени повреждения тканей, понесенные во время инъекции и равномерность распространения раствора ДНК в субретинальной пространства. Как правило 90-100% электропорации сетчатки будут представлены клетки, которые успешно включил и выразил введен плазмиды. Однако, когда факторинга в морфологии тканей и электропорации эффективность только 40-60% электропорации сетчатки будут пригодны для сравнительного анализа. Формирование Розетки и отслойки сетчатки в месте проникновения иглы почти всегда наблюдаются и эта область не должна использоваться для анализа. Успешное распространение ДНК во время микроинъекции приводит эффективно электропорации ткани боковое к месту проникновения иглы свободны от розетки и отрешенности. Глиоз также важные экспериментальные озабоченность, и почти всегда происходит в месте проникновения иглы. Однако, как с образованием розетки и отслойки сетчатки, глиоз, как правило, не имеет существенного значения в сторону электропорации ткани. Иммуногистохимических маркеров, таких как глиальные фибриллярный кислый белок (GFAP) могут быть использованы для определения уровня реактивной глиоз в анализируемых регионах падение в пределах допустимых порогов. Секционного сетчатки демонстрируя, что морфология электропорации сетчатке остается неизменной и что этикетки EGFP выражение отдельных электропорации клетки представлены. Примеры 3 дней после P0 электропорации (рис. 4A-C) и 14 дней после P0 электропорации (рис. 4D-F) представлены.
В P3 сетчатки большинство электропорации клетки расположены в neuroblastic слой (НБЛ) сетчатки, и не демонстрируют различные морфологические характеристики любого из дифференцированных нейронных или глиальные клетки сетчатки (рис. 4, б, С). По P14 электропорации клетки могут быть найдены в наружный ядерный слой (ONL) и внутренний ядерный слой (INL) сетчатки. Кроме различных меченых клеток теперь отображаются характерные морфологические признаки дифференцированных нейронов, включая интернейронов INL, фоторецепторы, и Мюллер глии (рис. 4E, F).
Рисунок 1. Анестезия у новорожденного (P0) мыши щенка и открытие глаз для субретинальной инъекции раствора ДНК. ) Новорожденных щенков размещены накровать дробленого льда для обезболивания. Глаз, который будет введен помещается вниз против льда. Б) расположение плавленого соединительного эпителия (B, стрелкой) век быть сокращены за око открытия. С) Резка веки вместе плавленого соединительного эпителия (С, стрелка), чтобы выставить на первый взгляд. D) открыл глаза следующее резки на сплавной переход. Е) разрез делается в глаз под в склеры под роговицу для облегчения вставки тупыми концами микро-инъекции шприцем. Шкала бары, B, C, D, E: 4 мм.
Рисунок 2. Введение тупыми концами микро-инъекции шприц и инъекцию ДНК плазмиды раствора в субретинальной пространства. ) Мультфильм схема демонстрирует правильное вставки микро шприца инъекции в глаза и урегулирования шприц наконечник в субретинальной пространства. Инъекция раствора ДНК в стекловидное тело камеры, прохождение шприцем через глаз в розетку, или инъекции в объектив приведет неудачных экспериментов с мало, если вообще электропорации клеток. Б) Проникновение шприца в разрез, сделанный в склеры стены и урегулирования шприц наконечник в субретинальной пространства. С) Инъекция раствора ДНК в субретинальной пространства. Шкала бары, B, C: 4 мм. Сокращения следующим образом: R-сетчатки, L-объектив, V-стекловидное тело, SRS-субретинальной пространства, BES-тупыми концами шприц.
Рисунок 3. Ориентация пинцет электрода на мышь для электропорации. ) Мультфильм схема демонстрирует ориентацию положительные и отрицательные весла из пинцет электрода по отношению к электропорации глаз. Зеленый представляет расположение вводили ДНК в субретинальной пространства. Пунктирные стрелки обозначают электрофоретического движения отрицательно заряженной ДНК вводят в направлении положительного электрода. ДНК-электрофорез происходит из субретинальной пространстве, прилегающем к отрицательным электродом в сетчатку, которая ориентирована на положительном электроде. В) положительное весло из пинцет помещается рядом с ДНК microinjected глаз и отрицательные весло находится рядом с неинъекционные глаз. С) Изображение с высоким увеличением пинцет электрода размещения на новорожденных мышей. Пунктирные линии показывают направление движения электрофоретической ДНК в направлении положительного электрода. Шкала бар, C: 5 мм.
Рисунок 4. Новорожденных мышей сетчатки (P0) электропорации с pCAG-EGFP и проанализированы в послеродовой день 3 (Р3) и послеродовой день 14 (P14). AC) конфокальной образы секционного сетчатки P3 электропорации с pCAG-EGFP в точке Р0. Большинство электропорации сидеть в клетках сетчатки neuroblastic слой (НБЛ). (DF) конфокальной образы секционного P14 сетчатки электропорации с pCAG-EGFP в точке Р0. Электропорации клетки могут быть выявлены в наружный ядерный слой (ONL) и внутренний ядерный слой (INL) сетчатки. Шкала Бары, AF: 50 мкм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В естественных условиях электропорации представляет быстрый и эффективный метод для преобразования клеток сетчатки с помощью плазмидов экспрессии ДНК. Этот метод позволяет экспериментатору выполнить усиление функции исследования эктопически введения гена под контролем повсеместно выразил промоутером или совершать потери функциональных исследований с помощью shRNA строит таргетинга генов, представляющих интерес. Кроме того, несколько плазмид ДНК может быть электропорации одновременно, что позволяет экспериментат...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа финансировалась NIH R01EY020560-01 и WM Keck молодой ученый в области медицинской премии Research. Авторы хотели бы поблагодарить Иосифа Bedont за его помощь во время визуализации сетчатки препаратов и инъекций.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Буфер Насыщенные Фенол | Invitrogen | 15513-039 | N / A |
| Хлороформ | JT Baker | 9180-03 | N / A |
| Ацетата натрия | JT Baker | 3470-05 | 3 М акции |
| Быстрый зеленый FCF | Фишер Biotech | BP123-10 | 10% акций |
| Изопропиловый спирт приготовительные | Tyco Healthcare | 6918 | N / A |
| 30-guage иглы | Terumo медицинской корпорации | SG2-3013 | N / A |
| Exmire микрошприца | Ито корпорации | MS * E05 | N / A |
| Tweezertrode (пинцет электрода) | BTX Инструмент, ООО Genetronics | 522 | N / A |
| Electro площади Porator (electroporator) | BTX Инструмент, ООО Genetronics | ECM-830 | N / A |
| Октябрь соединения | Сакура Finetek США | 4583 | N / A |
Ссылки
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
