Методическая статья

Слепой кишки Процедура прокола Лигирование

DOI:

10.3791/2860

⸱

7 мая 2011 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology School of Medicine, Temple University , 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Temple University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиной модели слепой кишки перевязки и проколы, как ценным инструментом для изучения человеческих сепсиса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сепсис у человека характеризуется набором системных реакций в ответ на интенсивную и массивную инфекцию, которую организм хозяина не смог локализовать. В настоящее время сепсис входит в десятку основных причин смертности в отделениях интенсивной терапии США 1. При сепсисе выделяют две установленные гемодинамические фазы, которые могут перекрывать друг друга. Начальная фаза (гипердинамическая) определяется как массированная выработка провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода макрофагами и нейтрофилами, что влияет на проницаемость сосудов (приводя к гипотонии), функцию сердца и вызывает метаболические изменения, кульминацией которых становятся некроз тканей и полиорганная недостаточность. Следовательно, наиболее частой причиной смерти является острое повреждение почек. Вторая фаза (гиподинамическая) представляет собой противовоспалительный процесс, включающий нарушение презентации антигенов моноцитами, снижение пролиферации и функции лимфоцитов, а также усиление апоптоза. Это состояние, известное как иммуносупрессия или иммунодепрессия, резко повышает риск нозокомиальных инфекций и, в конечном счете, смерти. Механизмы этих патофизиологических процессов изучены недостаточно. Поскольку обе фазы сепсиса могут вызвать необратимые и непоправимые повреждения, крайне важно определить иммунологический и физиологический статус пациента. Это основная причина, по которой многие терапевтические препараты оказались неэффективными. Один и тот же препарат, введенный на разных стадиях сепсиса, может быть терапевтическим, нанести вред или не оказать никакого эффекта 2,3. Для понимания сепсиса на различных уровнях крайне важно иметь подходящую и комплексную модель на животных, которая воспроизводит клиническое течение заболевания. Необходимо охарактеризовать патофизиологические механизмы, возникающие при сепсисе, и контролировать условия модели для тестирования потенциальных терапевтических средств.

Для изучения этиологии сепсиса у человека исследователи разработали различные модели на животных. Наиболее широко используемой клинической моделью является лигатура и пункция слепой кишки (CLP). Модель CLP заключается в перфорации слепой кишки, что приводит к попаданию содержимого кишечника в брюшную полость и вызывает выраженный иммунный ответ, индуцированный полимикробной инфекцией. Данная модель воспроизводит клинически значимые условия, характерные для человека. Как и у людей, у мышей, которым проведена процедура CLP с последующей инфузионной терапией, наблюдается первая (ранняя) гипердинамическая фаза, которая со временем переходит во вторую (позднюю) гиподинамическую фазу. Кроме того, профиль цитокинов схож с профилем при сепсисе у человека, для которого характерно усиление апоптоза лимфоцитов (см. обзоры 4,5). В связи с множественностью и перекрытием механизмов, вовлеченных в развитие сепсиса, исследователям необходима подходящая модель сепсиса с контролируемой степенью тяжести для получения согласованных и воспроизводимых результатов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Лигирование слепой кишки и прокол, как мышь Модель по правам Сепсис

Для этой процедуры C57BL / 6 мышей (7-9 недель) используются.

  1. Анестезию мыши путем введения внутрибрюшинно раствор 1:1, кетамина (75mg/kg) и ксилазина (15мг/кг). В качестве примера можно вводить 30 мкл раствора в 1:01 мышь весом 20 граммов. Кроме того, мышь может быть анестезии ингаляционными изофлуран использования испарителя анестетиков.
  2. Бритье брюшко мыши и дезинфекции области, первое применение бетадин решение следует вытирая с 70% спиртом (номер 1 на рисунке последовательности ниже). Хлоргексидин может быть использован как альтернативный антисептиком. Дополнительно: стерильный драпировка может быть использована для поддержания в чистоте.
  3. В асептических условиях, практика 1 до 2 см срединной лапаротомии и подвергать слепой кишки с прилегающей кишечника (2 и 3).
  4. Слепая кишка плотно лигировали с 6,0 шелковых шва (6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon) на его базе ниже подвздошно-слепой кишки клапан, и перфорированные один или два раза с 19-иглы (4 и 5) на том же стороны слепой кишки. Пожалуйста, обратите внимание, что длина лигируют слепой кишки определяется как расстояние от дистального конца слепой кишки перевязки точка будет определять степень тяжести. Расстоянии> 1 см производит высококачественных сепсисом при расстоянии ≤ 1 см производит средне-и низкосортных сепсиса. Также обратите внимание, что использование метода слепой кишки перфорация, показанный здесь, отличается от стандартного насквозь проколов техника (введение иглы через слепой кишки). Оба способа надежно производить тот же исход сепсиса. Однако один недостаток техники насквозь том, что она не способствует регулирования количества кала экструдированного, когда слепая кишка сжимается.
  5. Слепая кишка затем мягко сжала чтобы выдавить небольшое количество кала от перфорации сайтов (6). Слепая кишка возвращается в брюшную полость и брюшины закрыта с 6,0 швов шелка. (7).
  6. Кожа закрыта с 7 мм клипы Reflex (RS-9258, Roboz Хирургические инструменты) или Мишель раны клипов (7 мм, RS-9270) (8).
  7. Resuscitate мышей путем введения подкожно 1 мл подогретого 0,9% солевого раствора с использованием 25G иглу. Эта жидкость мера реанимации будет побуждать гипердинамического фазы сепсиса. Это важный шаг описан далее в разделе обсуждения.
  8. Дополнительно: Inject подкожно бупренорфин (0.05mg / кг массы тела) или трамадола (20mg/kg массы тела) для послеоперационного обезболивания. Имейте в виду, что эти опиатов может подавлять дыхание и передвижения, и эти эффекты могут быть ошибочно интерпретированы как признаки сепсиса.
  9. Животные размещаются временно на грелку или же немедленно возвращены в клетку с воздействием инфракрасной лампой нагрева 150W, пока они не оправиться от наркоза. Время восстановления составляет от 30 мин до 1 часа.
  10. Обеспечить свободный доступ к пище и воде (гидрогель), размещенные на дно клетки.
  11. Мыши контролируются каждые 12 часов за выживание в течение одного-двух недель или эвтаназии в различные моменты времени для анализа различных параметров.

В качестве контрольных для опытно-конструкторских, шам животных будут следовать лапаротомии технику без перевязки и пункции.
От шести до 12 часов после хирургического мышей процедуры станут вялыми и развитие лихорадки, пилоэрекции, диарея, сбившись, и недомогание, и все признаки сепсиса. Мыши с очень тяжелым сепсисом едва ли могут двигаться до смерти и демонстрируют резкое снижение температуры тела. На данном этапе мышам должны быть умерщвлены, чтобы избежать длительной боли и страданий.

Рисунок 0

2. Наиболее распространенные анализируемых параметров

Для оценки результатов процедуры, различные параметры могут быть проанализированы в органах, клеточных экстрактов или другими биологическими жидкостями. Образцы могут быть собраны в различные моменты времени от 3 часов до одной недели после хирургического вмешательства.

  1. Мыши выживания.
  2. Цитокины и хемокинов в сыворотке крови, брюшной полости и органов экстрактов.
    1. Интерлейкина-6: Производство и выпущен моноциты, дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, Т-лимфоциты, гранулоциты, тучные клетки и многие другие типы клеток. Он играет важную роль в фазу острой реакции и воспаление.
    2. Фактор некроза опухоли-α: Pleiotrophic цитокина, который играет центральную роль в воспалении и апоптоза. Подготовлено моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и фибробласты.
    3. nterleukin-1β: Продюсеры моноциты, НК-клетки, дендритные клетки, В-клетки и Т-клеток. Вызывает лихорадку и синтез белков острой фазы.
    4. Интерлейкин 10: Способствует фагоцитарной поглощения и Th2 ответа, но подавляет antigан презентации и провоспалительных Th1 ответа.
    5. Интерлейкин 10: Способствует фагоцитарной поглощения и Th2 ответа, но подавляет презентации антигена и провоспалительных Th1 ответа.
    6. Моноцитарный хемотаксиса белка-1 (также известный как CCL2): Новобранцы моноциты, ячеек памяти T, и дендритные клетки к местам повреждения тканей и инфекции.
    7. KC (CXCL1): Продюсер макрофаги и эндотелиальные клетки. Мышь KC является мощным аттрактанта нейтрофилов и активатор.
    8. RANTES: моноцитов хемоаттрактант. Он может chemoattract нестимулированных CD4 + / CD45RO + Т-клеток памяти и стимулировало CD4 + и CD8 + Т-клеток с наивны и памяти фенотипы.
    9. Интерферон-γ: выделяемый Th1 клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов, дендритных клеток и естественных киллеров (НК) клетки. Увеличивает презентации антигена и литической активности в макрофагах и подавляет активность клеток Th2. Способствует адгезии и обязательным, необходимые для миграции лейкоцитов и способствует активности клеток NK.
    10. Высокая мобильность группы В-1 белка: в моноцитов является ядерного фактора каппа-B активатора путем связывания с клеточным рецептором для продвижения гликирования конечных продуктов (RAGE), активизируя высвобождение провоспалительных медиаторов в поздней стадии сепсиса.
  3. Миелопероксидаза определения в органах в качестве меры нейтрофилов инфильтрации. Миелопероксидазы (МПО) является ферментом пероксидазой наиболее обильно присутствующие в нейтрофильных гранулоцитов. Это лизосомальных белков, хранящихся в азурофильных гранул нейтрофилов. МРО гема пигмент, который вызывает его в зеленый цвет выделений богат нейтрофилов, таких как гной и некоторые формы слизи.
  4. Бактерии нагрузки в органах и крови, измерить как количество колониеобразующих единиц на миллилитр.

3. Представитель Результаты

Процедура CLP изначально производится в штамм мыши C57BL / 6. Мы протестировали несколько параметров для модуляции тяжести сепсиса, изменяя длину труб и толщина иглы как показано на рисунках 1 и 2. Среди этих факторов, но длина перевязки, кажется, более эффективным, чем толщина иглы изменить процент выживания. Как показано на рисунке 1, увеличение длины перевязки более чем на 1 см провоцирует рост смертности на 100% по сравнению с мышами, имеющие перевязки ≤ 1см. Увеличение толщины иглы также снизился процент выживаемости с 100% (с помощью иглы 22G) до 55% (с помощью иглы 19G) с двумя проколами. Мы также проверили влияние на CLP C57BL / 6 и 129SvJ мышей для определения различных линий мышей дисплей аналогичных или различных восприимчивость к CLP-индуцированной сепсисом. Рисунок 3 показывает, что при тех же условиях, 129SvJ мышей были более восприимчивы к инфекции, чем C57BL / 6, свидетельствует увеличение смертности процентов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Влияние перевязки длина слепой кишки на животных выживание. CLP был выполнен в C57BL / 6 мышей с использованием двух различных длин слепой кишки труб. Это единственный параметр существенно влияет на выживаемость животных, так как все животные в группе с перевязкой площадь более 1 см умер менее чем за 3 дня по сравнению с группой животных, имеющих перевязки площадью 1 см прим. (П = 8).

Рисунок 2
Рисунок 2. Влияние толщины иглы на выживание. CLP был выполнен в C57BL / 6 мышей с использованием двух различных размеров иглы 19G и 22G. Мыши с использованием перфорированной слепой кишки 19G иглу показали 55-60% выживаемости. В отличие от мышей с использованием перфорированных слепой кишки 22G иглу показали 100% выживаемости, хотя они испытывали типичные симптомы воспаления в течение первых 3-4 дней, которые исчезли после 4 дней (п = 8).

Рисунок 3
Рисунок 3. Сравнение сепсис восприимчивости между двумя различными штаммами мыши. Модель CLP был выполнен в 129SvJ и C57BL / 6, на тех же условиях. В конце периода оценки процент выживания 129SvJ штамм был на 25% меньше, чем в C57BL / 6, напряжение, что указывает на более высокую восприимчивость к воспалению индуцированных полимикробная инфекции. (П = 6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы подробно показать, как выполнить модель CLP у мышей и модулировать степени тяжести.

По сравнению с другими моделями животных сепсиса, CLP могут быть выполнены в любой мыши штамма разного возраста и пола. Это относительно простой и недорогой хирургической операции. В этой модели, степень тяжести имеет непосредственное влияние на процент выживания. Длина труб, толщина иглы и число проколов являются параметрами, которыми можно управлять для модуляции тяжести / смертность CLP. Следовате...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.
Животные были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и утверждается ухода за животными и использовать комитета при Университете Темпл.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Пенсильвании Министерства здравоохранения.
Доктор Мигель Гарсия Тоскано был докторской сотрудник в Университете Темпл, который финансируется Альфонсо Мартин Эскудеро Фонд в течение этого исследования.
Мы хотим поблагодарить Илья Йорданов и Кевин Kotredes для изготовления видео.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
Кетамин Ketaset 0856-2013-01
Ксилазин AnaSed NADA # 139-236
29G инсулина шприц Exel 26028
Шелковая нить, 6-0 PROLENE Ethicon 8680G
19G и 25G иглы BD 305186
Бритва Генеральный питания Генеральный питания
Инфракрасные лампы Отопление Генеральный питания Генеральный питания
Мишель раны клипы 7мм Roboz Хирургическое Instr RS-9270
Ухо Loop маски Fisher Scientific 19-130-4181
Препарирование ножницы Roboz Хирургическое Instr RS-6702
Бетадин раствор VWR 63410-992
Хирургические щипцы Roboz Хирургическое Instr RS-5135
70% изопропиловый спирт площадку Fisher Scientific 22-031-350
Бупренорфин Бедфорд Labs 55390-100-10
Трамадол Sigma-Aldrich 42965

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
  2. Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. The enigma of sepsis. J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).
  3. Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes. Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).
  4. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
  5. Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
  6. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J Surg Res. 102, 45-49 (2002).
  7. De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis. Shock. 23, 11-17 (2005).
  8. Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis. Cytokine. 14, 162-169 (2001).
  9. Turnbull, I. R. Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture. Shock. 19, 310-313 (2003).
  10. Miyaji, T. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).
  11. Torres, M. B., De Maio, A. An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome. J Surg Res. 125, 88-93 (2005).
  12. Doi, K. AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality. Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).
  13. Wilson, M. A. Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis. J Trauma. 41, 622-627 (1996).
  14. Zanotti-Cavazzoni, S. L. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).
  15. Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34, 250-260 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи