Microiontophoresis влечет за собой перемещение ионов из микропипетки в ответ на разность электрических потенциалов между внутренней и внешней микропипетки. Биологически активные молекулы таким образом доставляется в пропорции к электрическим током. Проиллюстрируем ацетилхолина microiontophoresis в сочетании с микроманипуляция изучать эндотелий-зависимой вазодилатации в микроциркуляции.
Методическая статья
Microiontophoresis и Микроманипуляция для Прижизненное флуоресценции микроциркуляции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микроионтофорез заключается в пропускании тока через кончик микропипетки для доставки растворенного вещества в определенную область исследуемого препарата. Микроионтофорез позволяет имитировать синаптическую передачу1, обеспечивая воспроизводимую доставку нейромедиаторов и нейропептидов к нейронам2. Пренебрежимо малый объем вытесняемой жидкости позволяет избежать механического воздействия на экспериментальный препарат. Адаптация этих методов для исследования микроциркуляции3 позволила изучать механизмы вазодилатации и вазоконстрикции на микроскопическом уровне in vivo4,5. Ключевым преимуществом такой локализованной доставки является возможность изучения вазомоторных реакций в определенных участках микрососудистой сети без инициирования системных или рефлекторных изменений артериального давления и кровотока в тканях, что позволяет выявить внутренние свойства микрососудов.
Ограничением микроионтофореза является то, что точную концентрацию агента, доставленного в интересующую область, трудно определить6. Тем не менее, его высвобождение из кончика микропипетки пропорционально интенсивности и продолжительности тока выталкивания2,7, благодаря чему в определенных экспериментальных условиях (описанных ниже) можно легко установить воспроизводимые зависимости между стимулом и ответом. Дополнительные факторы, влияющие на микроионтофоретическую доставку, включают концентрацию растворенного вещества и степень его ионизации в растворе. Внутренний диаметр кончика микропипетки должен составлять ˜ 1 μm или меньше, чтобы минимизировать диффузионную «утечку», которой можно противодействовать с помощью удерживающего тока. Таким образом, для выталкивания катиона используется внешний (положительный) ток, а для его удержания внутри микропипетки — отрицательный ток.
Изготовление микропипеток осуществляется с помощью высокотехнологичных электронных вытяжников8. Микропипетки вытягивают из стеклянных капиллярных трубок, содержащих фитиль, который «затягивает» раствор в кончик микропипетки при заполнении с заднего конца («обратное заполнение»). Это выполняется путем введения микрокапиллярной трубки, соединенной со шприцем с нужным раствором, и впрыскивания раствора в просвет микропипетки. Микроманипуляторы позволяют точно разместить микропипетки внутри экспериментального препарата. Микроманипуляторы, установленные на подвижном основании, могут быть расположены вокруг препарата в соответствии с топографией микрососудистых сетей (описано ниже).
В данном протоколе демонстрируется микроионтофорез ацетилхолина (ACh+ Cl-) на артериолу в препарате мышцы поднимателя языка (cremaster muscle) мыши (см. соответствующий протокол: JoVE ID#2874) для индукции эндотелий-зависимой вазодилатации. Подача стимула синхронизирована с регистрацией оцифрованных изображений с помощью электронного триггера. Использование трансгенных мышей Cx40BAC-GCaMP29 позволяет визуализировать внутриклеточные кальциевые ответы, лежащие в основе вазодилатации в эндотелиальных клетках артериол в живом микроциркуляторном русле.
Протокол
1. Уходу и использованию животных
После рассмотрения и одобрения со стороны институциональных уходу и использованию животных комитета, мышей-самцов не менее 12 недель использования. Мышь анестезией с фенобарбиталом натрия (60 мг / кг) через внутрибрюшинного (ф) инъекции. На протяжении хирургических процедур и экспериментальных протоколов, анестезия поддерживается за счет добавки (10-20% от первоначальной инъекции, ф) по мере необходимости (каждые 30-60 минут, указывает выход ответ на ноги или хвост щепотку). После завершения экспериментальной процедуры мышь передозировки с фенобарбиталом (ф) и эвтаназии цервикальным сдвигом.
2. Микропипетки и Microiontophoresis
- Microiontophoresis микропипетки (внутренний диаметр кончика, ~ 1 мкм) получают из боросиликатного стекла капилляров использованием горизонтальных съемник пипетки. Наши иметь ~ 5 мм Конус для жесткости; больше сужается являются более гибкими.
- Микропипетки которые засыпаны 1M АХ (Figure1A-C), растворенного в 18,2 МОм воды. Для засыпки, микрокапиллярных трубка подключена к 0,2 мкм фильтр соединен с шприц, содержащий агонист интереса (рис. 1). Они могут быть легко сфабрикованы (см. ниже) или купить у коммерческих поставщиков. Микрокапиллярных трубка вставляется в заднюю часть микропипетки и АЧ решение поставляется в просвет при выводе микрокапиллярных трубку, как микропипетки заливки. Холдинг микропипетки с его кончик направлен вниз, пузырьки воздуха удаляют, осторожно стряхивая микропипетки.
- Микропипетки закреплен в держателе установлен в микроманипулятора (рис. 2). Обладатель серебряной провод, соединяющий решение АЧ в микропипетки на внешний вывод, что, в свою очередь, подключен к положительному выводу microiontophoresis программиста. Второй серебряной проволоки закреплены на краю тканевого препарата связан с отрицательным выводом для завершения цепи, как кончик микропипетки является передовой в физиологическом растворе в течение подготовки.
- Сохраняя ток применяется для предотвращения вазодилатации (или люминесцентные ответ), когда кончик микропипетки расположен рядом с артериол стене. Сохранение ток будет меняться в зависимости от размера кончика микропипетки (внутренний диаметр = 1 мкм) и агонист концентрации, но очень воспроизводимые для определенных параметров (мы используем ~ 200 нА для 1M АХ, 1 мкм совет). Сохранение текущей перестает совпадающих с доставкой выброса тока через электронные триггером (дополнительные рис. 1) синхронизирован с началом получения изображений.
3. Микроманипуляция
- Пользовательские платформы для столик микроскопа XY был изготовлен из ферромагнитного нержавеющей стали. Размеры платформы (1 / 8 "X 12" X 13 ") позволяют достаточно места для размещения микроманипуляторами вокруг экспериментальной подготовке в соответствии с пожеланиями (рис. 2А). Микроманипуляторы прикреплены к магнитной базы (рис. 2Б) позволяют позиционирование как это диктуется подготовки. Это размещаются непосредственно на сфабрикованных площадку вокруг подготовки к позиционирования микропипетки на интересные сайты (рис. 2С).
4. Представитель Результаты
- С кончика микропипетки расположен рядом с артериол, есть флуоресценции ответ на АХ (сохраняя ток, чем регулируется для предотвращения утечки АЧ). Ниже порога стимула не было никакого эффекта. Однако, как интенсивности раздражения увеличилась, эндотелиальные флуоресценции кальция клетка постепенно увеличилась за большего расстояния по артериол, как и интенсивность флуоресценции на месте раздражения (рис. 3).
Рисунок 1. Метод Засыпка Microiontophoresis Пипетки. ) Микрокапиллярных трубки (зеленая стрелка) закреплен в компрессионный фитинг (синяя стрелка), подключенных к 0,2 мкм (фиолетовая стрелка), который затем прикрепляется к шприц с 1М АХ. B) микрокапиллярных трубки подается в microiontophoresis пипетки через задний конец и решения смещается, чтобы заполнить просвет микропипетки. C) После пипетки заполнен, удерживая наконечник вниз и мягко Флик выше конус для удаления пузырьков (черная стрелка).
Рисунок 2. Custom Платформа микроманипулятора размещения. ..) Ферромагнитной нержавеющей стали платформы был сделан на пользовательский MVX10 микроскопом базу, содержащую XY поступательного стадии B) Циркуляр магнитного баз прикреплены к нижней части компактный 3-х осевой микроманипуляторами C) Микроманипуляторы расположены вокруг экспериментальной подготовки (См. связанный протокол: Юпитер ID # 2874) для изучения конкретных объектов, представляющих интерес.л компактные размеры и универсальность позволяют нескольким микропипетки, которые будут использоваться одновременно.
Рисунок 3. Кальций флуоресценции в артериол. Кальций флуоресценции эндотелиальных клеток, выстилающих артериол стены увеличилась с интенсивности раздражения. Первые 3 панели показано изображение флуоресценции ответы) 250 нА, В) 500 нА и C) 1000 нА выброса тока (всего 500 мс длительность импульса). Расстояние, на котором эндотелиальных флуоресценции кальция клетка увеличилась указывается в скобках переменного тока (~ 130, 270 и 400 мкм соответственно). Опорной линии через артериол в каждой панели указывает, где флуоресценция ответов (F / Fo) к АХ были записаны в месте раздражения. D) Записи F / Фо время против повышения стимулов АХ. Как выброса текущей увеличилось, F / Фо увеличился по амплитуде и длительности. Обратите внимание, что 100 нА стимул был ниже порога и не подействовало.
Дополнительное рисунке 1. Принципиальная схема электронного триггера. Эта схема сопряжена с параллельным портом с персонального компьютера. При активации он обеспечивает постоянное TTL импульсов 5В. 7805 чип регулятор напряжения 5В подключены к 9-12В постоянного тока (аккумулятора соответствующего напряжения штраф). Выход из 7805 обеспечивает питание для Quad Двусторонние коммутатор и выход схемы. Входной через 1K резистор от компьютера.
Обсуждение
Протокол, описанный здесь, демонстрирует методы подготовки и реализации микропипетки для microiontophoresis. Доставка ацетилхолина используется для иллюстрации кальциевой сигнализации основной эндотелий-зависимой вазодилатации в артериолы наркозом мыши. Наши результаты показывают, что расстояние, на котором АЧ увеличивает эндотелия увеличивает кальция клетка флуоресценция с интенсивностью выброса тока от microiontophoresis микропипетки (Рис. 3). Отсутствие флуоресценции увеличение в состоянии покоя указывает незначительной утечки АЧ из микропипетки. Отсутствие реакции на 100 нА интенсивности раздражения (рис. 3, легенды) показывает, что пороговая интенсивность стимуляции требуется для эндотелиальных кальция клетка увеличивается. Эти методы могут быть легко адаптированы для других вазоактивных агентов и тканевые препараты.
Практические соображения: В работе с microiontophoresis изучать артериол реактивности, несколько вещей, которые должны быть признаны. Хотя это оказалось трудным для определения фактической концентрации агониста доставлен, стимул-реакция кривые воспроизводимых внутри и между препаратами. Они могут быть выполнены путем проведения постоянной длительности импульса (например, 500 мс) и различной выброса тока (например, 250, 500 и 1000 нА, рисунок 3). Кроме того, выброс ток может быть постоянным (например, 500 нА) и длительностью импульса разнообразны (например, 250, 500 и 1000 мс). Для ссылки на действия определен агонист концентрации, препарат может быть superfused с соответствующим решением 5. Потому что движущей силой для растворенного вещества выброса электрического движения заряда, агент должен быть доставлен нести суммарный заряд быть перемещены из микропипетки. Чтобы убедиться, что агент интересов первичных носителей заряда, он растворяется при высокой концентрации (например, 1 м для АЧ), чтобы минимизировать электроосмос. Когда это требует манипулирования рН раствора заполнения микропипетки, транспортное средство контроля необходимо установить какой-либо неспецифических эффектов. Соответствующие элементы управления должны быть выполнены для прохождения тока в одиночку (например, с помощью микропипетки заполнены изотонический солевой раствор). Эффективное расстояние для диффузии агент от своего сайта релиз должен быть установлен и является наиболее легко определить эмпирическим путем исчезновения физиологического ответа (например, расширение кровеносных сосудов или повышение внутриклеточного кальция на выброс ацетилхолина) в качестве микропипетки позиционируется на определены расстояния от целевой сайт. На практике эффективная длина диффузии в значительной степени зависит от того, как кончик микропипетки позиционируется в ткани, например, если кончик нажатой в ткани и ее наконечник окклюзии, чем выброс нарушается. Чрезмерное соединительной ткани особенно хлопотным и должны быть удалены из поверхности ткани во время хирургической подготовки. Внимание следует также уделить возможности истощения кончик назначенным агентом. Это сводится к минимуму, используя сравнительно коротких импульсов (например, ≤ 1 с). С устойчивой токов (например, несколько секунд), агонистов может быть исключен из кончика быстрее, чем он может быть заменен путем диффузии из объема заполнения решение в микропипетки.
Потому что незначительный объем смещается с microiontophoresis, если он пытается изменить местных ионной среде (например, для доставки деполяризующего K + стимул), это не может быть эффективно достигнуто с microiontophoresis но легко достигается при давлении выброс жидкости в объеме оказывает желаемого композиции. Для местных стимуляции артериол, микропипетки советы с внутренним диаметром 2-3 мкм хорошо работать с выбросом давлением 4-5 МПа (28-35 кПа) и длительности импульса (например, 1 секунду) управляется с электромагнитного клапана 10. Где устойчивой доставки агента из микропипетки на микрососудов требуется, давление выброса является предпочтительным использованием микропипетки соответствующих внутренним диаметром наконечника (например, ~ 10 мкм) 11,12. Гидростатической колонки известных высота с клапаном крана обеспечивает недорогое, четко определенные включения / выключения постоянного напора давление. Расход определяется внутренний диаметр кончика пипетки и вождение давления. Как всегда, транспортное средство контроля необходимы для исключения неспецифической акции давления выброса.
Раскрытие информации
Все процедуры и протоколы с участием животных были утверждены уходу и использованию животных комитета Университета Миссури и осуществляется в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных. Производство этой статье был организован Стэнфордского Photonics.
Благодарности
Исследования в лаборатории авторов при поддержке Национального института здравоохранения грантов R37-HL041026, R01-R01 и HL086483-HL056786 (SSS) и F32-HL097463 и T32-AR048523 (РВ) из Общественного США службы здравоохранения.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Используемый Материал | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Боросиликатное стеклянные капилляры | Warner инструменты | GC120F-10 | |
| Горизонтальное Внесите Puller | Саттер инструменты | Модель P-97 | |
| Ацетилхолин хлорид | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| Адаптер для Луер центр | Martech | AC1343 | Для обеспечения микрокапиллярных трубы |
| 0,2 мкм нейлон Titan фильтр | ВС Шри- | 42204-НН | Низкий объем хранения для минимизации потерь |
| 5 мл шприц | Becton Dickinson Ко- | 309603 | |
| Внесите держатель | Warner инструменты | E45W-M12VH | |
| Серебряные провода | Warner инструменты | AG10W | 0,25 мм диаметр |
| 3-осевой микроманипулятора | Сиския Дизайн Инструменты | DT3-100, MXB, MXC, МГБ / 8 | Компоненты для манипулятора, как показано |
| microiontophoresis текущего программиста | Инструменты Всемирного Precision | Модель 260 | |
| запуска устройства | Обычай | обычай | Схема представлена в Suppl. Рисунок 1 |
| плита из нержавеющей стали | McMaster-Карр | 1 / 8 "X 12" X 12 " | По проекту |
| Усиленный цифровой камеры | Стэнфордский Photonics Inc | XR/Mega-10 | Интеграция с программным обеспечением управления Пайпер |
Ссылки
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
Перепечатки и разрешения
