Мы представляем подробный протокол для агробактериальной вирус-индуцированных генов (VIGS) анализа в хлопка. Вирус табачной погремушкой (ТРВ)-производные векторов VIGS были развернуты, чтобы побудить глушителей РНК хлопка GrCLA1, Cloroplastos alterados один ген. Альбиноса фенотип вызванных глушителей GrCLA1 наблюдался на всходов в течение 2 недель после прививки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хлопчатник (Gossypium hirsutum) является одной из самых важных сельскохозяйственных культур в мире. Было предпринято значительных усилий по молекулярной селекции новых сортов. Полномасштабный функциональный анализ генов хлопчатника отставал от большинства современных видов растений, вероятно, из-за большого размера его генома, дупликации генов и полиплоидии, длительного цикла роста и сложности генетической трансформации1. Чтобы облегчить высокопроизводительные функциональные генетические и геномные исследования хлопчатника, мы стремимся разработать быстрые и эффективные методы транзиентного анализа для оценки функций генов хлопчатника.
Вирус-индуцированный сайленсинг генов (VIGS) — это мощный метод, разработанный на основе посттранскрипционного сайленсинга генов (PTGS) хозяина для подавления репликации вирусов2,3. VIGS с помощью Agrobacterium был успешно применен для различных функциональных геномных исследований у широкого спектра видов двудольных, таких как Solanaceae, Arabidopsis и бобовые, а также однодольных, включая ячмень, пшеницу и кукурузу3,4. Поскольку этот быстрый и эффективный подход позволяет избежать трансформации растений и преодолеть функциональную избыточность, он особенно привлекателен и подходит для функционального геномного анализа сельскохозяйственных культур, таких как хлопок, которые не поддаются трансформации.
В данном исследовании мы приводим подробный протокол системы VIGS (вирус-индуцированного сайленсинга генов), опосредованной Agrobacterium, для хлопчатника. Среди нескольких вирусных векторов VIGS вирус тряски табака (TRV) поражает широкий спектр хозяев и способен активно распространяться по всему растению, вызывая при этом лишь легкие симптомы у хозяев5. Для мониторинга эффективности сайленсинга ген GrCLA1, гомолог гена Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 (AtCLA1) у хлопчатника, был клонирован и вставлен в бинарный вектор VIGS pYL156. Ген CLA1 участвует в развитии хлоропластов6, и предыдущие исследования показали, что утрата функции AtCLA1 приводит к появлению альбиносного фенотипа на настоящих листьях7, что служит отличным визуальным маркером эффективности сайленсинга. Примерно через две недели после инфильтрации Agrobacterium на настоящих листьях начал проявляться альбиносный фенотип, при этом эффективность сайленсинга составила 100% во всех повторных экспериментах. Подавление экспрессии эндогенного гена было также подтверждено методом ОТ-ПЦР. Примечательно, что сайленсинг эффективно происходил во всех протестированных нами сортах, включая различные коммерческие сорта, выращиваемые в Техасе. Этот быстрый и эффективный метод VIGS, опосредованный Agrobacterium, представляет собой мощный инструмент для быстрого крупномасштабного анализа функций генов на уровне всего генома хлопчатника.
Протокол
1. Саженцы выращивают хлопок
- Сейте семена возвышенности хлопка (Gossypium hirsutum) многообразие Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR и Deltapine 90 в горшках (7 см в диаметре), содержащий Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, штат Вашингтон).
- Имейте в горшках поднос, покрытый пластиковым куполом при 23 ° С, 120 мкЕ м -2 с -1 света, с 12 час light/12 час светового дня в темном роста комнате.
- Удалить купол, когда две семядоли появились.
- Примерно две недели спустя, использование растений с двумя полностью расширена семядоли для анализа VIGS. На данном этапе, настоящие листья еще не вышли (рис. 1).
2. Построить VIGS вектора, несущего ген GrCLA1
- Amplify 1 Cloroplastos alterados ген хлопок (GrCLA1) с помощью ПЦР с праймерами GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'и GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3 "из библиотеки кДНК Г. raimondii тканях листа.
- Дайджест ПЦР продуктов GrCLA1 с EcoRI и KpnI и вставьте в pYL156 (pTRV-RNA2) вектора на перевязки.
- Экран клонов на LB агаром, содержащей 50 мкг / мл канамицина. Проверка конструкции ограничением пищеварения фермента и последовательности.
- Преобразование плазмиды Agrobacterium в tumefaciens GV3101 электропорацией и восстановить в жидкой среде LB при 28 ° C. Выберите трансформантов на пластинах с LB + канамицину (50 мкг / мл) + гентамицин (25 мкг / мл). Бактерии могут быть сохранены в 25% глицерине при -80 ° С для длительного использования.
3. Выполните VIGS прививки
- За три дня до прививки, полоса замороженные запасы глицерина tumefaciens Agrobacterium проведения pYL192 (ТРВ): RNA1, pYL156 (ТРВ): RNA2 (вектор в одиночку) и pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 на LB агаром, содержащей 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте пластин при 28 ° С в течение 24 часов.
- За два дня до проникновения VIGS, выбрать одну колонию для каждой конструкции из выше пластин и привить его в 5 мл LB среде, дополненной 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина; Grow бактериальной культуры при 28 ° С в течение ночи в каток со скоростью 50 оборотов в минуту.
- Передача выше культуры в колбу с 50 мл LB среде, дополненной 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина, плюс 10 мМ MES (2 - (4 морфолино)-этан сульфокислоты) и 20 мкМ acetosyringone. Рост культуры при 28 ° С в течение ночи в шейкере со скоростью 50 оборотов в минуту.
- На следующий день, спином вниз агропромышленного бактериальных клеток при 4000 оборотов в минуту в течение 5 минут, повторно приостанавливать культуры в инфильтрации буфера, содержащего 10 мМ MgCl 2, 10 мМ MES и 200 мкМ acetosyringone. Отрегулируйте OD 600 из культуры до 1,5.
- Оставить культуру на скамейке при комнатной температуре в течение 3 часов.
- До агробактериальной инфильтрация, удар нижней семядолей хлопчатника с 25 G иглу без пирсинга через семядоли. Один или два отверстия (в зависимости от мягкости ткани) были кулаками по каждому разделу семядолей (рис. 2).
- Смешайте агробактериальной суспензионной культуре pYL192 (ТРВ): RNA1 и pYL156 (ТРВ): RNA2 или pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 в соотношении 1:1; рука проникнуть смесь из нижней семядолях через ранив сайтов с помощью 1 needleless мл шприца (рис. 3).
- Обложка растения с пластиковым куполом и оставить проникли растений при комнатной температуре, при тусклом освещении на ночь.
- Передача растений к росту комнате с температурой 23 ° С, 120 мкЕ м -2 с -1 света с 12-часовой световой / 12 часа темно цикла.
Примечание: VIGS работает, когда растения находятся в стадии либо 23 ° С или теплице (25-28 ° С). Когда температура относительно невысока (от 23 до 25 ° С), легче для прививки и фенотип является более равномерным по сравнению с более высокими (28-30 ° С) или колебались температуры. Покрытие растений с куполом и делает VIGS более эффективным.
- Изучить глушителей фенотипа в 7 ~ 8 дней после проникновения. Настоящих листьев из замолчать растений pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 начал отображать альбиноса фенотип (рис. 4). Растения проникли с агробактерий проведения pYL156 (ТРВ): RNA2 служить в качестве контроля.
- Проверьте эффективность генов путем изучения уровня экспрессии эндогенных генов с использованием обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) с РНК, выделенной из-под контроля и заставил замолчать растения хлопка.
Примечание: VIGS-е изд растения должны находиться под карантином, содержащихся условиях и растения должны быть надлежащим образом автоклавного и утилизировать после анализов, как ТРВ имеет широкий круг хозяев и уведомлению возбудителя.
4.Представитель Результаты:
Примерно через две недели после ручной инфильтрация с агробактериальной смеси, альбиноса фенотип вызванных GrCLA1 глушителей явно наблюдается на настоящих листьев. Глушителей КПД достигает почти 100% в нескольких экспериментов с более чем 50 заводах. Замолчать растений дисплей равномерно распределенных и очень сильный альбиноса фенотипа на новых развивающихся листьев с мозаикой на листья бузины (рис. 4).
Рисунок 1. Хлопка рассады на примерно две недели старой сцены с двумя полностью развернут семядоли для агробактериальной инфильтрации.
Рисунок 2. Штамповка крошечные отверстия на нижней стороне семядолей хлопчатника использованием 25 G иглы для облегчения агробактериальной инфильтрации.
Рисунок 3. Рук инфильтрации агробактериальной смесь в семядоли хлопок через ранив сайтов с помощью шприца needleless
Рисунок 4. Альбино фенотипа появилась на VIGS замолчать хлопчатника. Четыре сорта показано на рисунке. ) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR; С) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
VIGS был доказан, чтобы быть мощным инструментом в области функциональной геномики анализа временно сбить экспрессии эндогенных генов. В этом исследовании, мы разработали агробактериальной VIGS за счет использования TRV основе двоичного вектора. Хлопок CLA1 (GrCLA1) ген был разработан как визуальным маркером для мониторинга эффективности глушителей. Мы последовательно приобрела 100% генов эффективности глушителей, свидетельствует альбиноса фенотип, появляющиеся на настоящих листьев во всех разновидностях испыта...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим доктора. SP-Динеш Кумар и Юла Лю для ТРВ-VIGS векторов, и д-ра. Чак Kenerley, Терри Уилер, Джим Старр и Bayer CropScience за предоставление семян хлопчатника. Эта работа финансировалась NSF для LS и NIH для PH
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагентов и оборудования | Компания | Каталог / серийный номер | Комментарии |
| Каток | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Агро-бактерии культуры |
| Инкубатор | Sheldon Manufacturing, Inc | 01046209 | Агро-бактерии культуры |
| UV / Vis спектрофотометр | Beckman Coulter | Модель: DU530 | Измерение ОП |
| Гена Pulser | BioRad | Модель: 1652076; Последовательный: 154BR3880 | Электропорация |
| Генератор импульсов контроллера | BioRad | Модель: 1652098; Последовательный: 232BR4833 | Электропорация |
| Micropulser Электропорация кювет | BioRad | 165-2081 | Электропорация |
| 1 мл шприцев | BD Biosciences | 30962 | Прививка агропромышленного бактерии |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU # 553001 | Рост рассады |
| Стихаря горшок | TOPlastics | GPS-3001B2 | Рост рассады |
| МЧС моногидрат | USB | 18886 | Проникновение буфер |
| Acetosyringone | Сигма | D134406 | Проникновение буфер |
Ссылки
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
