Мы представляем лентивирусов методика генетических манипуляций и визуализации одной обонятельной сенсорных аксонов нейронов и его терминал разветвление В естественных условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лентивирус-опосредованной генетических манипуляций и визуализация Обонятельные сенсорные нейроны В естественных условиях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Развитие точных обонятельных схема опирается на точные проекции обонятельной сенсорных нейронов (ОСН), аксоны их синаптических целей в обонятельной луковице (OB). Молекулярные механизмы OSN аксон роста и ориентации не до конца понятны. Манипулирование экспрессии генов и последующей визуализации одного аксонов OSN и их терминал беседка морфологии до сих пор подвергают сомнению. Для изучения функций генов на одном уровне ячейки в указанный период времени, мы разработали лентивирусов техника выполнения манипулировать экспрессии генов в OSNs в естественных условиях. Лентивирусов частицы поступают в OSNs путем микроинъекции в обонятельный эпителий (OE). Выражение кассеты затем постоянно интегрироваться в геном трансдуцированных OSNs. Зеленый флуоресцентный белок определяет выражение инфицированных OSNs и очертания всей своей морфологии, в том числе аксон терминал беседке. Из-за короткого времени оборота между микроинъекции и репортер обнаружения, исследования функции генов может быть сосредоточено в пределах очень узкого периода развития. С помощью этого метода, мы обнаружили GFP выражение в всего лишь три дня и в течение трех месяцев после инъекции. Мы достигли как по-выражения и shRNA опосредованной нокдауна от лентивирусов микроинъекции. Этот метод обеспечивает подробные морфология OSN клеточных тел и аксонов на одном уровне клетка в живом организме, и таким образом позволяет характеристику кандидата функции генов обонятельных во время развития.
Протокол
1. Подготовка
Эта процедура биобезопасности 2-го уровня, поэтому все следующие препараты производятся в биологически опасных капотом, где микроинъекции процедура будет выполнена.
- Подготовка и подогрева 37 ° С водяной кровати: Заполнить пластиковый мешок хранения с водой - печать и установлен на опустели нагревательный блок инкубатора. Это позволит восстановить мышей после инъекции.
- Заполните контейнер для биологически опасных отходов с 10% хлорной извести на подходящего объема для погружения всех отходов от этой процедуры.
- Подготовка небольшой открытый блюдо из 70% этанола и второе блюдо с стерилизо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микроинъекции лентивирус приводит к постоянной передаче генные конструкции в геномной ДНК OSN. Такой подход позволяет нам выполнять краткосрочные или долгосрочные манипуляции генов-кандидатов через гиперэкспрессия или опосредованной shRNA нокдауна. Кроме того, мы можем флуоресцентно этикетке одного OSNs в существующие линии трансгенных мышей для наблюдения совместно локализации популяций одоранта рецептор. Микроинъекция требуется для лентивирусов трансдукции OSNs. Мы попытались промывки лентивирус суспензии в полость но.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Этот протокол является биологической безопасности 2-го уровня совместимым. Все необходимые рабочее пространство, средства индивидуальной защиты, и вирусные меры содержатся отходы были установлены соответствующим образом. Все животные процедуры были выполнены в соответствии с IACUC руководящих принципов.
Благодарности
Это исследование проводится при поддержке НИЗ DC052256 и DC006015 и NSF 0324769 на QG и T32-DC008072 к BS.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Микроинъекция: новорожденных мышей microinjected использованием 5 мкл Hamilton шприца (Hamilton # 7647-01), оснащенный 33 иглы (Гамильтон # 7762-06).
Иммуноцитохимическая Реагенты: Первичные антитела: кролик поликлональных антител GFP (Molecular Probes # A-6455), куриные поликлональных антител против OMP (пользовательский) (Chen и др., 2005.), Морская свинка поликлональных антител против VGlut2 (Millipore # AB2251). Вторичные антитела: Су2-сопряженных осла анти-кролик (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy-3-сопряженных осла-анти-курица (Джексон Immunolab # 703-165-155) и Cy5 конъюгированного козьего анти-морской свинки (Jackson Immunolab # 106-175-008). Разделы были установлены на стеклах с Fluoromount G (Южный Biotech # 0010-01) с 50ng/mL DAPI хроматина пятно раствором.
Конфокальной микроскопии: Z-стек изображений выполнены при помощи Olympus Flouview FV1000 конфокальной микроскопии и изображения собираются и обрабатываются в 3D проекции использованием Olympus FV10-ASW 2,01 конфокальной сбора и анализа программного обеспечения.
Ссылки
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Ad....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
