Поставка диабетом 2 типа островков для исследований является недостаточным. Здесь мы делимся нашими протоколом для изоляции островков из пациентов, перенесших частичную поджелудочной железы. Этот подход представляет собой уникальное место для получения островков с диабетом 2 типа и клинически соответствует, не больных диабетом в достаточном количестве для фундаментальных и клинических исследований.
Методическая статья
Изоляция по правам островки из не вполне Pancreatectomized Пациенты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследования в патогенезе сахарного диабета 2 типа и островков Лангерганса неисправности 1 были затруднены ограниченной доступности диабетом 2 типа островков с донорами органов 2. Здесь мы делимся нашими протоколом для изоляции островков из человеческой ткани поджелудочной железы получены из диабетом 2 типа и без диабета пациенты, которые подверглись частичной поджелудочной железы из-за различных заболеваний поджелудочной железы (доброкачественная или злокачественная опухоль поджелудочной железы, хронический панкреатит, и общего желчного протока и двенадцатиперстной кишки опухоли) . Все пациенты участвуют дали свое согласие на это исследование, которое также было одобрено местным этическим комитетом. Хирургических образцов были немедленно доставлены в патологоанатом, внесшие мягкие и здоровые ткани поджелудочной железы появляются выделения островок, сохраняя поврежденной ткани в диагностических целях. Мы обнаружили, что выделить более 1000 островков, нам надо было начинать, по крайней мере 2 г ткани поджелудочной железы. Также важное значение для нашего протокола было заметно разбухают ткани при введении фермента средах, а затем фарш ей помочь пищеварению за счет увеличения площади поверхности.
Чтобы расширить сферу применения нашего протокола включить случайный случай, когда большое количество (> 15 г) тканей человека поджелудочной доступна, мы использовали Ricordi камеры (50 мл) переваривать ткань. Во время переваривания, мы вручную покачал Ricordi камеру 3 при интенсивности, которая колебалась от образца в соответствии с его уровнем тканях фиброз. Градиент discontinous Ficoll затем был использован для отдельных островков из ацинарных ткани. Мы отметили, что ткани гранулы должны быть достаточно маленькими, чтобы быть однородно ресуспендировали в среде Ficoll с плотностью 1,125 г / мл. После изоляции, мы культурные островки под напряжением свободных условиях (без встряхивания или вращение) с 5% CO 2 при 37 ° С, по крайней мере 48 часов для того, чтобы облегчить их функциональное восстановление. Широкое применение нашего протокола и его улучшения в будущем могло бы позволить своевременной уборки большого количества человеческих островков от диабетической и клинически соответствует, не больных диабетом, в значительной степени продвижения сахарного диабета 2 типа исследований.
Протокол
1. Поджелудочной ткани коллекции в операционной
- Хирург выполняет частичная резекция поджелудочной железы.
- После размещения поджелудочной образца в окно на льду, доставить его немедленно патологоанатомом.
2. Ткань выбор для изоляции островок
- Патологоанатом выбирает ткань, которая появляется мягкий и здоровым, сохраняя поврежденной ткани в диагностических целях. Фиброзных тканей и образцов, предлагая менее 2 г полезной ткани исключены из островок изоляции.
- Погрузите ткани поджелудочной железы в растворе Евро Коллинз и поставить на лед в лабораторию.
3. Выделение человека островков
- Взвесьте ткани поджелудочной железы, а затем поместить его в 10 см блюдо.
- Положить 150 мл RPMI СМИ в 500 мл колбу.
- В 250 мл колбу, подготовить решение пищеварительный фермент, объединяя 130 мл RPMI сред с 100 мг / мл ДНКазы и 20 мл РИ Liberase 5mg/ml. Draw 10 мл этого раствора в шприц для введения ткани поджелудочной железы.
- Inject пищеварительных ферментов решение в ткани поджелудочной железы, с целью раздувать это однородно. Если это предотвратить, фиброз, пищеварения, скорее всего, удастся. Затем фарш ткани в ~ 4 мм 3 штуки на льду.
4. Человек цепь пищеварения поджелудочной железы
- Соберите пищеварения цепи, как показано на рисунке 1. Направление потока в камере Ricordi в внизу и снаружи в верхней части камеры.
- Добавить оставшийся раствор пищеварительного фермента 500 мл колбу до общего объема 300 мл и вставьте термометр.
- Передача ткани поджелудочной железы в камеру, вставьте сетки (диаметр пор: 600 мкм) и три нитрида кремния Мрамор (диаметр 15 мм), закрыть камеру и включите насос с потоком установлена на уровне 140 мл / мин.
- Когда температура достигает схеме 37 ° С, начала отсчета времени и периодически брать пробы, чтобы определить когда нужно остановиться пищеварения. Окрашивание дитизоном (2 мг / мл) позволяет микроскопическим визуализации островков в переваривается ткани 4.
- Как только островки отделены от окружающих ацинарных ткани, быстро остановить пищеварения, разместив нагреватель на льду и добавлением 200 мл холодной СМИ мыть (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% FBS) к цепи.
- Сбор островок раствора в 250 мл конические пробирки, как он выходит из пробирки. Продолжайте, пока цепь пуста.
Рисунок 1. Человека цепь пищеварения поджелудочной железы человека цепь пищеварения поджелудочной железы включает в себя камеру Ricordi содержащие сетки (диаметр пор: 600 мкм) и три из нитрида кремния мрамора (диаметр 15 мм). Отток из камеры приводится в колбу коллекции ткани перистальтического насоса (140 мл / мин). Стрелки указывают направление потока. Оптимальная температура для ферментативного пищеварения поддерживается путем погружения нагревательная спираль в 37 ° С водяной бане.
5. Стиральная после пищеварения
- Центрифуга 250 мл конические пробирки, содержащие островок решения при 1000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную, ресуспендируют островок гранул в промывочной СМИ (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% FBS) и распространять ее в равные доли по 50 мл конические пробирки. (Дополнительно:. Распределить на дополнительные конические пробирки для улучшения промывки) центрифуги при 1000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и осторожно освободите гранулы ручным встряхиванием.
6. Очистка от градиента Ficoll
- Ресуспендируют гранулу Ficoll средств массовой информации с плотностью 1,125 г / мл, рН 7,4 и медленно наложения 10 мл аликвоты Ficoll сред с плотностью 1,080, 1,060 и 1,037 г / мл.
- Центрифуга Ficoll градиентов при 2400 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 20 мин.
7. Островок Сбор и культуры
- После центрифугирования, различные компоненты тканей можно отличить по их разделами в градиент.
- Удалите верхний слой, состоящий из жира и соединительной ткани.
- Тщательно урожая первый слой островок агрегатов на 1.037-1.060 г / мл интерфазе. Этот слой содержит самые чистые изолированных островков. Сбор фракций отдельно для эффективной изоляции.
- Сбор второй, менее чистые долю островок агрегатов на 1.060-1.080 г / мл интерфазе.
- Развести Ficoll градиент, добавив мыть СМИ (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% ЭТС) к каждой конической трубе до общего объема 50 мл. Центрифуга при 1000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 5 мин.
- Удалите супернатант всасывания. Будьте осторожны, как шарик может быть потеряно из-за градиента Ficoll.
- Вымойте гранулы шго мытья СМИ (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% ЭТС) и центрифуге при 1000 оборотов в минуту, 4 ° С в течение 5 мин. Повторите использованием средств массовой информации островок культуры
- Ресуспендируют островков в культуре средств массовой информации и разместить их в инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° С в течение 24-48 часов перед дальнейшей обработкой.
Результаты
Наш протокол дали в среднем ~ 500 островков на грамм ткани поджелудочной железы, хотя это очень разнообразны между препаратами связаны преимущественно с различиями в фиброз и активность коллагеназы. Мы достигли> 90% островок чистоты первым окрашиванием дитизона во время обработки ткани, то готовя их через 24 часа после изоляции. Для определения качества очищенной островков, мы тестировали в течение 25 мМ глюкозы-стимулированная секреция инсулина в статических условиях в течение 2 часов. Мы обнаружили, секреция инсулина сравнима с островками получена из ECIT островок изоляции и центров трансплантации. Как островков изолированы от частично pancreatectomized pancreata не предназначены для трансплантации островков, оценка общего IEQ не считается критическим фактором.
Важно отметить, что наш метод позволил нам выделить островки для функциональных исследований, проведенных в 25 частичном pancreatectomized пациентов в период между 2005 и 2008 5. Эти островки были проанализированы на глюкозо-стимулированную секрецию инсулина и конкретное выражение белка западных промокательной и иммуногистохимии. Островки изолированы от частично pancreatecomized pancreata также может быть использован для сравнения генов и экспрессии белка профилей, ультраструктурным внешний вид и функциональные ответы, не страдающих диабетом и диабетической островков. Поскольку Есть более пациентов, перенесших частичную поджелудочной железы, чем Есть доноров органов, наш протокол может обеспечить достаточное образцы и данные должны быть собраны для надежного статистического анализа.
Обсуждение
Используя наш протокол, человеческих островков можно выделить из ткани поджелудочной железы собранных из частичное поджелудочной железы. Успех этого протокола зависит от того, насколько бережно в течение нескольких критических точках. Чтобы сохранить бета-клеток жизнеспособность, очень важно, чтобы образец быстро перевозиться на льду в лабораторию. Кроме того, продолжительность пищеварения ткани должны быть оптимизированы в соответствии с эмпирически степени фиброза тканей и ферментативной активности средств массовой информации. Это также относится и к степени механической силы, приложенной вручную Ricordi камеры. Таким образом, чтобы получить хороший урожай островок, протокол лучше поручать посвященный ученому или техническим помощником. Первоначальные неудачи является нормой, если команда уже имеет опыт в островок изоляции.
Есть ключевые различия между нашими островок протокол изоляции и стандартный человеческий метод изоляции островок: 1) Хотя мы используем ткани поджелудочной железы подвергается несколько часов ишемии во время хирургической процедуры, они сразу же обрабатываются на месте. Это в отличие от pancreata эксплантированных от смерть мозга доноров для поджелудочной железы / островок трансплантации, которые остаются ишемическая течение нескольких часов во время распределения и доставки на островок средство изоляции. 2) Мы коллагеназы вводить прямо в ткани поджелудочной железы, в то время как стандартный протокол влить его в проток поджелудочной железы. 3) Мы отдельных островков использовании разрывных градиент Ficoll вместо сбора островки с непрерывным градиентом Ficoll использованием COBE процессор клетки.
В случаях, когда хирургическое образца слишком фиброзных или скудные выделения достаточного количества островков, ткани все еще может быть восстановлена путем лазерной захвата микродиссекции (НОК) 10. Это позволяет использовать данные экспрессии генов, чтобы быть восстановлены практически из каждого образца, даже если островок изоляции сбоя или выхода, очень низок. К сожалению, НОК не производит живые клетки для функциональных исследований и их количество, как правило, недостаточно для протеомных анализа. Таким образом, используя LCM параллельно с нашим протоколом пищеварения коллагеназы для получения островков может быть наиболее эффективным способом для обработки хирургических образцов.
При сборе ткани для островок изоляции от частичной pancreatectomies, важно, чтобы тщательно изучить историю болезни пациента и метаболическое состояние. Частично pancreatectomized пациента могут быть затронуты типа 3c диабет, то есть диабет вторичной по отношению к поджелудочной расстройства, ведущие к операции 6. Среди 43 участвующих пациентов, которые подверглись этой операции в нашем отделении в 2010 году, 32 были без диабета, 5 пострадали от диабета типа 2 и 6 был диабет типа 3c. Эти данные согласуются с предыдущими исследованиями, указывая на нарушения метаболизма глюкозы и диабета в значительной долей пациентов, страдающих от рака поджелудочной железы или хронического панкреатита 6. Мы рассматривали диабет как первостепенные происхождения, если она была диагностирована по крайней мере за год до появления симптомов, ведущих к поджелудочной железы 7. Уровень антител против островок аутоантигенов также должны быть измерены для оценки потенциальных аутоиммунного происхождения из сахарного диабета 8. Потому что пациент переживает поджелудочной железы может страдать от недиагностированных диабетом или глюкозы нетерпимой, все не больных сахарным диабетом следует уделять перорального теста на толерантность к глюкозе до поджелудочной железы 9.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотим поблагодарить наших многочисленных коллег, которые оказывают помощь, советы и критические вход на различных этапах проекта. Производство этого видео статья была поддержана с помощью средств из германского министерства образования и научных исследований (BMBF) в Немецкий центр исследований диабета (DZD, http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA ( http://www . imidia.org ) и Университетской больницы Карл Густав Карус в Технологическом университете Дрездена. Научных исследований, ведущих к этим результатам получил финансирование от Седьмой рамочной программы Европейского сообщества (FP7/2007-2013) для Инновационные инициативы медицины под соглашение о гранте N ° 115005.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Имя | Компания | Номер в каталоге | |
| Оборудование | |||
| 1 мл серологические пипетки (CELLSTAR) | Greiner Bio-One | 604181 | |
| 10 мл серологические пипетки (CELLSTAR) | Greiner Bio-One | 607180 | |
| 25 мл серологические пипетки (CELLSTAR) | Greiner Bio-One | 760180 | |
| 10 мл шприцев | BD (Becton, Dickinson и общество) | 300912 | |
| 50 мл шприцев | BD (Becton, Dickinson и общество) | 300865 | |
| 5 мл шприц | BD (Becton, Dickinson и общество) | 309050 | |
| 18 G 1,1 / 2 иглы Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson и общество) | 304622 | |
| 27 gx1 / 2 иглы | Браун | 4658300 | |
| 27 GX3 / 4 иглы Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson и общество) | 302200 | |
| 3 см клеточных культур блюдо 2x2 мм сетки | Nunc | 174926 | |
| 20 см культуры ткани блюдо | BD (Becton, Dickinson и общество) | 353003 | |
| 6 см Удобная ручка чашки Петри | BD (Becton, Dickinson и общество) | 351016 | |
| 150 мл бутылка хранения | Corning Incorporated | 431175 | |
| 250 мл колб Эрленмейера | Schott Duran | 21 217 36 | |
| 500 мл колб Эрленмейера | Schott Duran | 21 217 44 | |
| 250 мл завинчивающейся крышкой конической трубе Центрифуга Нижний | Corning Incorporated | 430776 | |
| 50 мл Сокол конической трубе | BD (Becton, Dickinson и общество) | 352070 | |
| 260 мл Easyflask Неочищенные | Nunc | 156800 | |
| Millex В. фильтрующее устройство Duropore (0,22 мкм) | Millipore | SLGV033RB | |
| Бутылка Top вакуум-фильтра (PES 70 мм Диаметр мембран, 0,22 мкм, размер пор, 45 мм, размер шеи, 500 мл объема) | Corning Incorporated | 431118 | |
| Денситометр (Densito 30px) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 | |
| Быстрый PES фильтрующее устройство 0,2 мкм | Nalgene | 569-0020 | |
| Батарея отопления | BioRep Technologies Inc | HC-02 | |
| Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 | |
| Насос Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 | |
| Ricordi камеры (металлические сетки с 600 мкм диаметром пор) | BioRep Технологии ООО | Модель 50-U-01, последовательный 0503-001 | |
| Подготовка стенда | BioRep Технологии ООО | 50-PS-01 | |
| O-Ring | BioRep Технологии ООО | OR-50-U-01 | |
| Нитрида кремния Мрамор (15 мм набор из 9) | BioRep Технологии ООО | SN-01 | |
| Кремний труб | Tygon | R 3603 8,0 X4, 0 мм | |
| Хирургические щипцы | Браун | BD168R | |
| Хирургические ножницы (Aesculap) | Браун | BC273R | |
| Водяная баня OLS 200 | Грант | МНК 200 | |
| Реагенты | |||
| Коллагеназы -> Liberase RI (100 мг) | Roche | 11815032001 | |
| D (+)-Глюкоза | Merck | 1.08337.1000 | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Merck | 1.16743.1000 | |
| Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 | |
| ДНКазы I (100 мг) | Roche | 10104159001 | |
| Dulbeccos 1xPBS | ПАА лаборатории | H15-002 | |
| Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 | |
| Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) | ПАА лаборатории | А15-101 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 | |
| Плода бычьей сыворотки (FBS) | Гибко | 10270-106 | |
| 2 - (4 - (2-гидроксиэтил) - 1-пиперазинил)-ethansulfons ‰ Юр (HEPES) | Рот | 9105,3 | |
| NaOH, 5 М | клинические аптеки, больницы | - | |
| Пенициллин / стрептомицин (100x) | ПАА лаборатории | P11-010 | |
| Pipettaid (ЭКСПРЕСС) | BD (Becton, Dickinson и общество) | 357591 | |
| Potassiumchlorid | Fluka | 60132 | |
| Potassiumdihydrogenphospate безводный | JT Baker | 0241 | |
| Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 | |
| Средний RPMI 1640 [-] D-глюкозы [+] L-глютамин | Гибко | 11879-020 | |
| Средний RPMI 1640 [+] L-глютамин | ПАА лаборатории | E15-840 | |
| Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Средства массовой информации и решений
Решение дитизона
- Растворите 100 мг DTZ в 10 мл ДМСО и разбавить в 40 мл PBS
- Стерильный фильтр решение (0,22 мкм)
Раствора фермента
- Растворите 100 мг Liberase РИ в 20 мл RPMI СМИ 1640 (без добавок)
- Растворите 100 мг ДНКазы в 1 мл RPMI 1640 средств массовой информации (без добавок)
- Стерильный фильтр решение (0,22 мкм) и держать фермента на льду
Вымойте СМИ (1000ml/5.5mM Глюкоза)
- Растворите 100 мл ФБС (тепло инактивированная)
- Добавить 450 мл RPMI 1640 (не глюкозе)
- Добавить 450 мл RPMI 1640 (11 мМ глюкозы)
- Стерильный фильтр решение (0,22 мкм)
Островок культуры средств массовой информации (500 мл / 5,5 мМ глюкозы)
- Растворите 10 мл 1М HEPES (рН 7,4)
- Добавьте 50 мл ФБС
- Добавьте 5 мл пенициллина / стрептомицина (100x)
- Добавить 2,75 мл 1 М раствора глюкозы
- Добавить 432,25 мл RPMI 1640 (не глюкозе)
- Стерильный фильтр решение (0,22 мкм)
Евро Коллинз решения
- 4083 г калия hydrogenphosphate
- 70,0 г глюкозы
- 2237 г хлористого калия
- 14,80 г калия monohydrogenphosphate
- 1680 г натрия гидрокарбоната
- 40 мл раствора электролита (Е 154)
- рН 7,4
- Добавить дистиллированной водой до 2000 мл
- Стерильный фильтр решение (0,22 мкм)
Ficoll маточного раствора
- Добавить 1000 мл раствора Евро Коллинз до 500 г Ficoll
- Добавить 8,94 г HEPES
- Движение ночью до Ficoll решается
- рН 7,4
- Измерьте плотность
Ficoll Градиенты
- Рассчитать количество FBS, Евро Коллинз решения и Ficoll маточного раствора в зависимости от плотности
- Смешайте 3 решения и измерения плотности с денситометр
- Добавить Евро Коллинз решений или Ficoll маточного раствора до плотности корректируется
- Стерильный фильтр решение (0,22 мкм) и хранить при 4 ° C
Ссылки
- Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality. Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).
- Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects. Diabetes. 53, 624-632 (2004).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes. 37, 413-420 (1988).
- Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. A simple method of staining fresh and cultured islets. Transplantation. 45, 827-830 (1988).
- Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients. Islets. 2, 30-36 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed? Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).
- Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. Pancreatic disorders and diabetes mellitus. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).
- Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies. Diabetes. 45, 926-933 (1996).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).
Перепечатки и разрешения
