Извлечение интактной почки у мыши: метод получения почки без почечной капсулы у мышиных моделей

Аннотация

Источник: Grainger, N. et al. Изоляция и визуализация живых, интактных кардиостимуляторных областей почечной лоханки мыши с помощью вибратомного сечения. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы описываем процедуру извлечения почки из забрюшинного пространства мыши. Извлеченная почка может быть дополнительно микродиссектирована для получения неповрежденной почки без почечной капсулы и окружающего жирового слоя.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Диссекция почки

1. Обезболивание мышей путем ингаляции 3–4% изофлурана в вентилируемом капюшоне. Подтвердите индукцию глубокой анестезии потерей рефлекса защемления пальцев ног и/или хвоста, а затем усыпьте мышей при вывихе шейки матки.
2. Нанесите 70% этанол на грудь, чтобы увлажнить шерсть. С помощью ножниц для наружного рассечения откройте брюшную полость через продольный разрез, лезвия ножниц должны быть направлены в сторону от животного, чтобы предотвратить повреждение внутренних органов.
3. С помощью щипцов для внутренних тканей и ножниц для внутренней диссекции защемите кишечник и приподнимите его в сторону от брюшной стенки. Во время подъема кишечника разрежьте нижнюю часть кишечника, освобожденную от тела, в проксимальном отделе двенадцатиперстной кишки и дистальном отделе ободочной кишки, чтобы получить доступ к забрюшинному пространству, содержащему почки.
4. Как только почки обнажаются, извлеките их по отдельности. Аккуратно сожмите и приподнимите дистальный конец мочеточника (~4 мм от почки) с помощью тканевых щипцов. С помощью ножниц для препарирования разрежьте под защемленным мочеточником по направлению к почке. Продолжайте разрез под почкой, пока она не освободится от окружающей соединительной ткани.
   заметка: Чтобы максимизировать целостность тканей и консистенцию разреза во время вибратомного секционирования, почка должна быть как можно более неповрежденной. Чтобы обеспечить это, избегайте защемления или разрезания почки щипцами и ножницами для препарирования.
5. Поместите почку с прикрепленным мочеточником в ледяной раствор KRB. Повторите шаги экстракции с контралатеральной почкой, которую необходимо извлечь из тела мыши. Поддерживать почки в растворе KRB на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно перейдите к следующему разделу протокола, чтобы сохранить жизнеспособность тканей PKJ. Из-за своего анатомического расположения глубоко в паренхиме почки, PKJ лишен контакта с раствором KRB.

2. Подготовьте почку без почечной капсулы к рассечению вибратома

1. Переложите почку в чашку для препарирования, покрытую силиконовым эластомером (60 мм x 15 мм), и заполните ее ледяным раствором KRB до полного погружения почки.
2. Под рассекающим микроскопом закрепите почку у основания чашки, вставив мельчайшие булавки в проксимальный отдел мочеточника и через тонкую переднюю почечную капсулу или окружающую жировую ткань><. заметка: Будьте осторожны, чтобы не проколоть ткань паренхимы почки.
3. Используйте тонкие пружинные ножницы и внутренние щипцы для удаления жировой ткани из основания почки, чтобы обнажить дистальный отдел RP и проксимальный отдел мочеточника.
4. Удалите проксимальный отдел мочеточника и часть дистального отдела РП от основания РП с помощью тонких пружинных ножниц.
   заметка: Следите за тем, чтобы не разрезать окружающую почку паренхиму. Черная пунктирная линия на рисунке 1А указывает на приблизительное положение этого среза. Этот разрез создает плоское основание на почке для более равномерного разрезания тканей. При рассечении почки необходимо учитывать анатомическое положение области PKJ. На рисунке 1B показано, что интактная почка может быть разрезана в сагиттальной плоскости, чтобы обнажить мозговое вещество, сосочек (дистальное вещество, где сходятся собирательные протоки), а также проксимальный и дистальный отделы РП. Если бы сосочек был полностью обнажен, как показано на рисунке 1C, можно было бы визуализировать PKJ и проксимальную РП (prox RP). Однако этого не следует делать для техники вибратомии; это описание призвано сориентировать читателя на местоположение PKJ в целом, подчеркнутое анатомическим различием, показанным на проходящих световых изображениях области PKJ и средней области RP на рисунке 1D, E.
5. Проткните наружную почечную капсулу щипцами с тонким кончиком, отклоняя кончики от тела почки. С помощью щипцов каждой рукой зажмите свободные концы капсулы и отклейте их. Продолжайте отслаивать оставшуюся мембрану почечной капсулы до тех пор, пока она не будет полностью удалена.
   заметка: Почечная капсула представляет собой жесткий, волокнистый слой, который окружает почку. Его необходимо удалить перед вибратомным сечением для оптимальной резки.

Результаты

Рисунок 1: Базовая анатомия почки и расположение области кардиостимулятора PKJ.(А) Схема интактной почки, показывающая ориентацию РП и мочеточника. Почечная артерия и почечная вена отображаются красным и синим цветом соответственно. (Б) Интактная почка может быть разрезана по сагиттальной плоскости, чтобы обнажить внутренний аспект почки, включая мозговое вещество, с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашка Петри 60 мм x 15 мм	Сигма Олдрич	П5481	Тарелка для острого рассечения почек
Абсорбирующая бумага	Научный центр Фишера	06-666А	Чтобы подсушить почку перед применением клей
В6; 129S-Gt(ROSA)26Sor/J	Лаборатория Джексона	No 13148	Мыши GCaMP3
В6; 129S-Gt(ROSA)26Sor/J	Лаборатория Джексона	No 24105	Мыши GCaMP6f
В6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	Лаборатория Джексона	19079	Мыши smMHC-CRE
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	Лаборатория Джексона	No 13148	Мыши PDGFRa-CRE
этанол	Фамко-Аапер	ПДД 2Б-6	Для вскрытия
Сверхтонкие ножницы Бонн	Инструменты для точной науки	14083-08	Используется для внутренних ножниц для препарирования
Тонкие ножницы	Инструменты для точной науки	14060-09	Используется для наружной рассекательной обработки ножницами
Щипцы с тонким наконечником	Инструменты для точной науки	11254-20	Используется для тонкой диссекции почек
Изофлуран	Бакстер	ОНУВ 1001936060	Для анестезии
Силиконовый эластомер	Научный центр Фишера	NC9285739	Сильгард 184
Студенческие щипцы Адсона	Инструменты для точной науки	91106-12	Для бережного удержания и перемещения почка
Студенческие щипцы Dumont	Инструменты для точной науки	91150-20	Используется для внутренних рассекающих щипцов
Весенние ножницы Vannas	Инструменты для точной науки	15000-03	Для острого препарирования и очистки Изолированная почка

г.