Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка решений
- Приготовьте 1 л раствора бикарбоната Krebs-Ringer (KRB), содержащего 120,35 мМ NaCl, 5,9 мМ KCl, 15,5 мМ NaHCO3, 1,2 мМ Na2HPO 4,1,2 мМ MgCl2, 11,5 мМ глюкозы и 2,5 мМ CaCl2. В день использования поддержите раствор KRB на льду.
заметка: KRB можно хранить при температуре 4 °C в течение одной недели и следует предварительно пузырить смесью 97%O2 и 3%CO2 в течение не менее 10 минут перед использованием.
2. Вибратомное рассечение почки
- С помощью тупых щипцов аккуратно захватите и извлеките подготовленную почку из ледяного раствора KRB. Немедленно поместите почку на впитывающую бумагу на ~2–4 с, чтобы удалить лишнюю внешнюю влагу. Аккуратно прокатайте почку по абсорбирующей бумаге, чтобы убедиться, что все стороны паренхимы высохли, чтобы обеспечить оптимальное сцепление почки со стадией вибратомии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку почечная лоханка расположена внутри почки и, следовательно, защищена наружной паренхимой, этот короткий период сушки не наносит вреда целостности тканей.
- Немедленно нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея (~ 1 см2 ) на основание вибратомной пластины образца и с помощью тупых щипцов поместите почку мочеточниковой стороной вниз на область, покрытую клеем. Аккуратно надавите вниз на верхнюю часть почки плоским краем щипцов примерно на 10–20 с><, чтобы клей высох.
заметка: Чтобы стабилизировать почку во время этой процедуры, используйте дополнительную пару щипцов, чтобы удерживать почку в вертикальном положении, пока клей высыхает. Очень важно, чтобы почка прилегала к пластине образца в вертикальном положении, чтобы срезы были срезаны прямо. Чтобы убедиться, что почка успешно присосалась к пластине образца, осторожно надавите на боковую часть почки. Если почка успешно прилегла к пластине, основание почки должно оставаться прикрепленным к пластине.
- Надежно закрепите пластину для образцов на дне буферного лотка. Отрегулируйте уровень раствора KRB так, чтобы верхняя часть почки была полностью погружена. На этапах секции, по мере того как вибратомное лезвие продвигается глубже в буферный лоток, удалите раствор KRB, чтобы держатель лезвия не погрузился в раствор.
заметка: Если клей не полностью высох, прежде чем приступить к этому этапу, клей часто будет перемещаться вверх от основания к паренхиме почки. Этот избыток клея сделает секционирование более вариативным. Если это все же произошло, извлеките почку из тарелки и приступайте к подготовке свежей почки.
- Для автоматического вибратомного отрезания выберите начальное и конечное положения цикла резки вибратомного лезвия. Убедитесь, что эти положения находятся на расстоянии ~0,5–1 см от почки, чтобы убедиться, что при каждом продвижении лезвия вся плоскость почки рассекается.
- Подготовьте многолуночную пластину (24- или 48-луночную), заполнив лунки раствором KRB, и поместите пластину на лед.
заметка: При создании отдельные секции должны быть помещены в отдельные скважины, чтобы отслеживать глубину секции.
- Запустите процесс автоматической резки. Во время первоначального прохода лезвия убедитесь, что лезвие соприкасается с самой верхушкой почки. Если контакт не установлен, отрегулируйте начальное Z-положение лезвия.
- С помощью щипцов соберите участки, которые освобождаются от почки. Немедленно перенесите срезы в отдельные скважины и запишите Z-глубину срезов, чтобы измерить приблизительное расположение PKJ в срезах почек.
заметка: В зависимости от параметров среза некоторые участки могут не быть отделены от почечного блока. Если это произошло, осторожно используйте тонкие пружинные ножницы, чтобы вырезать участки из почкового блока. Пользователям также рекомендуется активно визуализировать срезы под световым микроскопом во время свободного плавания в отдельных лунках, чтобы обеспечить оптимальные условия разреза и расположение тканей. Срезы, содержащие PKJ, обычно получают на расстоянии ~ 1000–1500 мкм от верхней части почки.
- Продолжайте работу с протоколом секционирования до тех пор, пока области PKJ не станут более заметными. Обратитесь к разделу репрезентативных результатов для описания регионов PKJ по мере выполнения секционирования.
- На этом этапе оптимизируйте параметры секционирования, чтобы гарантировать, что секции равномерно освобождены от почечного блока и не повреждены. Кроме того, убедитесь, что области PKJ являются непрерывными и непрерывными, потому что разрушенные стенки PKJ не позволят адекватно визуализировать клетки внутри стенки из-за коллапса. Если стенки ломаются, уменьшите скорость резки и увеличьте толщину среза и продолжайте наблюдать за срезами под световым микроскопом для точной настройки параметров резки.
- Храните срезы при температуре 4°C в растворе KRB до начала экспериментов.
