Органоидная модель опухоли мочевого пузыря: метод ортотопической трансплантации органоидов мочевого пузыря в мышиный мочевой пузырь реципиента

Аннотация

Источник: Kim, Y. et al. Культивирование, манипуляции и ортотопическая трансплантация органоидов опухолей мочевого пузыря мыши.J. Vis. Exp.(2020)

В этом видео мы описываем ортотопическую трансплантацию культивируемых органоидов опухоли мочевого пузыря в мочевой пузырь мышей, чтобы изучить роль органной среды в развитии опухолей.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Субкультура органоидов опухолей мочевого пузыря
 

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется прохождение органоидов опухоли мочевого пузыря, когда они достигают 100–150 мкм в диаметре.

1. Добавьте 500 мкл коллагеназы/диспазы в органоидную среду в 24-луночный планшет с опухолевыми органоидами. Проводите пипеткой вверх и вниз по матрице базальной мембраны и среде. Инкубировать в течение 20 минут при 37 °C и собрать клетки в пробирку объемом 15 мл.
   заметка: Исследуйте органоиды, выделенные из матрицы базальной мембраны, под микроскопом. Если органоиды не отделены от матрицы базальной мембраны, увеличьте время инкубации или пипетку в несколько раз.
2. Добавьте 5 мл предварительно подогретого DMEM, центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 3 минут при 4 °C и аспирируйте надосадочную жидкость.
3. Ресуспендируйте гранулу с использованием 1 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА и 10 мкМ Y-27632. Выдерживать в течение 5 минут на водяной бане при температуре 37 °C. Энергично пипетируйте клетки вверх и вниз и нейтрализуйте трипсин, используя 5 мл DMEM с 10% FBS.
4. Центрифугируйте пробирку при давлении 400 x g в течение 3 мин при 4 °C и отаскуйте надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте гранулу с помощью 1 мл предварительно подогретой органоидной среды и подсчитайте количество одиночных опухолевых клеток.

2. Ортотопическая трансплантация органоида мочевого пузыря (рисунок 1A)

1. Подготовка органоидов опухоли мочевого пузыря к ортотопической трансплантации
   1. Перед трансплантацией культивируют органоиды опухоли мочевого пузыря в течение 5–7 дней, как описано выше.
   2. Добавьте 500 мкл коллагеназы/диспазы в органоидную среду в 24-луночный планшет с опухолевыми органоидами. Пипетка вверх и вниз по матрице базальной мембраны и среде. Инкубировать в течение 20 минут при 37 °C и собрать клетки в пробирку объемом 15 мл.
   3. Добавьте 5 мл предварительно подогретого DMEM, центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 3 минут при 4 °C и отаскайте надосадочную жидкость.
   4. Суспендируйте гранулу с 1 мл DMEM и перелейте раствор в чашку Петри диаметром 90 мм.
   5. Под микроскопом соберите 10–100 опухолевых органоидов с помощью микропипетки P200 и соберите их в микротрубку на льду.
   6. Центрифугируйте пробирку при давлении 400 x g в течение 3 минут при 4 °C и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
   7. Держите клеточную гранулу на льду до тех пор, пока мыши не будут готовы к операции.
2. Трансплантация подслизистой стенки мочевого пузыря
   1. Подготовьте голую мышь мужского пола в возрасте от 8 до 10 недель (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) по крайней мере за 1 неделю до эксперимента, чтобы дать ей возможность акклиматизироваться к новой среде. Введите энрофлоксацин (5 мг/кг) подкожно за 24 ч до операции.
   2. Очистите поверхность скамейки водой с мылом. Автоклавируйте хирургические инструменты перед хирургическим вмешательством и проводите операцию с использованием стерильных инструментов.
   3. Держите инсулиновый шприц 29 г, наконечники для пипетки и матрицу базальной мембраны на льду. Вводите кетопрофен (5 мг/кг) подкожно перед введением анестезии.
   4. Обезболите мышь 4% изофлураном в индукционной камере. После достижения общей анестезии положите мышь в положение лежа на спине и поддерживайте анестезию путем ингаляции маски с 2% испаренным изофлураном.
      заметка: Если время обезболивания превышает 30 минут, нанесите глазную мазь на оба глаза с помощью ватного тампона, чтобы избежать пересыхания роговицы.
   5. Нанесите повидон-йод стерильной марлей и протрите ее 70% этанолом. Повторяйте 3 раза каждый раз с новой марлей или ватным тампоном.
   6. Закройте анус и операционное поле одноразовыми стерильными хирургическими простынями.
   7. С помощью препарирующего микроскопа для увеличения сделайте небольшой поперечный разрез (меньше 1,5 см) на коже и мышечной стенке нижней средней линии живота стерильными хирургическими ножницами. Обнажите мочевой пузырь из брюшной полости и поддержите его ватными палочками, смоченными в физрастворе.
      заметка: Если мочевой пузырь наполнен мочой, осторожно надавите на мочевой пузырь, чтобы слегка декомпрессировать его.
   8. Ресуспендировать органоидные гранулы в 80 мкл органоидной среды, содержащей 50% матрицы базальной мембраны высокой концентрации (Таблица 1 и Таблица материалов).
   9. Введите органоидную суспензию в переднюю часть купола мочевого пузыря с помощью инсулинового шприца 29 г под препарирующим микроскопом.
   10. Закройте внутренний слой брюшной стенки антибактериальным рассасывающимся швом, а затем закройте внешний слой нейлоновым швом 4-0. Продезинфицируйте место операции повидон-йодом и 70% этанолом.
   11. Дайте мыши восстановиться под инфракрасным облучателем 10–15 мин. Следите за мышью, пока она не придет в сознание и моторику.
   12. Через сутки после операции проверьте общее состояние мыши и утечку анастомоза. Применяйте кетопрофен (5 мг/кг) один раз в сутки в течение 3 дней после операции и лечите энрофлоксацином (5 мг/кг) один раз в сутки в течение 10 дней после операции.
   13. Когда место разреза заживет (через 10–14 дней после операции), снимите швы. Контролируйте рост опухоли мочевого пузыря мыши в течение 2–3 недель после инъекции органоида опухоли.
   14. Если наблюдается рост опухоли мочевого пузыря, усыпьте мышь с помощью ингаляции углекислым газом и соберите всю опухоль мочевого пузыря. Вымойте его с помощью холодной DPBS (рисунок 1B).
   15. Чтобы проанализировать гистологию опухоли мочевого пузыря, окрашивайте залитый парафином участок ткани с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) (рис. 1B).

Органоидная среда опухоли мочевого пузыря мыши
Продвинутый DMEM/F-12 (Базовый средний)	10 мМ HEPES (pH 7,4)
10 мМ никотинамида	0,5x Добавка без сыворотки
2 мМ L-аланил-L-глутамин дипептид	1% пенициллин/стрептомицин
1 мМ N-ацетил-L-цистеин	50 нг/мл эпидермального фактора роста мышей
1 мкМ А 83-01

Таблица 1: Состав органоидной среды опухоли мочевого пузыря.

Результаты

Рисунок 1: Ортотопическая трансплантация органоидов опухоли мочевого пузыря.(А) Принципиальная схема ортотопической трансплантации органоидов опухоли мочевого пузыря голой мыши. (B) Репрезентативные изображения мочевого пузыря и окрашенных H&E срезов мышей, которым ортотопно трансплантировали органоиды опухоли мочевого пузыря. Увеличенные виды пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коническая трубка 15 мл	уровень звукового давления	50015
24-луночный планшет	Корнинг	No 3526
29 г инсулинового шприца	Шина	B299473538
Коническая трубка 50 мл	уровень звукового давления	50050
А8301	Токрис	2939	Концентрация в запасе: 25 мМ
Абсолютный этанол	Тэчжун	4023-2304
Рассасывающийся шовный материал	Генри Шейн	039010
Усовершенствованный DMEM/F-12	термо	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (голая мышь)	Чарльз Ривер	194
Коллагеназа I типа	термо	17100017	Исходная концентрация: 20 мг/мл
Коллагеназа II типа	термо	17100015	Исходная концентрация: 20 мг/мл
Коллагеназа/диспаза	сигма	10269638001	Исходная концентрация: 1 мг/мл
DMEM (модифицированная минимальная необходимая среда по Дульбекко)	Gibco	11965-118
ДМСО (диметилсульфоксид)	сигма	Д8418
DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко)	Велгене	ЛБ 001-02
Пониженный фактор роста Матригель (СКФ) Сниженный фактор роста (СКФ)	Корнинг	354230 (Английский	Использование для культивирования органоидов в планшетах
Матригель высокой концентрации (HC)	Корнинг	354248	Использование для трансплантации органоидов
1,5 мл микропробирки	Аксиген	MCT-150-C
лезвие
Солевой буфер	Компания JW Pharmaceutical
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco	25200072
Ультрацентрифужная трубка	Бекман Коултер	331372
Y-27632 дигидрохлорид	Абмоле	М1817	Концентрация в запасе: 10 мМ

г. Кабель гг. )