Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Подготовка зондов
- Подготовьте щупы из титаноникелевого сплава (длина 40 мм; диаметр 0,2 мм) с покрытием из смешанного сорбента 7 мм. Количество зондов зависит от временных точек, на которые нацелена вся процедура, и количества повторов (рекомендуется 3 на каждую временную точку).
заметка: Продолжительность и тип фазы экстракции могут быть скорректированы в зависимости от режима исследования, полярности метаболитов и матрицы образца.
- Приготовьте чистящую смесь, состоящую из хлороформа:метанола (v/v) в соотношении 2:1. Пипеткой нанесите 1,0 мл раствора на каждый стеклянный флакон объемом 2,0 мл и поместите в каждый флакон по одному щупу, предварительно проколотому через колпачок.<бр/>
заметка: Перед использованием очистите все щупы, чтобы удалить загрязняющие частицы.
- Поместите флаконы на мешалку и установите скорость перемешивания на 1 200 об/мин. Через 45 минут остановите устройство и промойте покрытия водой класса LC-MS.
- Поскольку покрытия должны пройти этап предварительного кондиционирования для их активации, приготовьте смесь предварительного кондиционирования, состоящую из метанола:вода (v/v) в соотношении 1:1. Нанесите пипеткой по 1,0 мл раствора на каждый стеклянный флакон объемом 2,0 мл и поместите в каждый флакон по одному зонду, предварительно проколотому через колпачок.
- Поместите флаконы на вихревую мешалку и установите скорость перемешивания на 1 200 об/мин.
- Через 60 минут остановите мешалку и промойте покрытия водой класса LC-MS.
- Стерилизуйте зонды в соответствии со стандартным протоколом стерилизации хирургического оборудования.
2. Извлечение
- Откройте стерильную упаковку непосредственно перед отбором проб, чтобы обеспечить стерильную среду.
- Введите два зонда непосредственно в кору головного мозга почек на 10 минут в каждую временную точку. Вся длина покрытия должна быть покрыта тканевой матрицей; Определенный угол не требуется, но обычно используется около 90 градусов.
заметка: Вся медицинская процедура проходит по стандартным протоколам в данном учреждении. Никаких изменений, касающихся выборки SPME, не рассматривается. Процедура включает в себя шесть следующих временных точек отбора проб: а) перед резекцией почки, in vivo от донора; б)–д) после 1 ч, 3 ч, 5 ч, 7 ч перфузии почки, ex vivo в камере органа; е) после реперфузии, in vivo от реципиента.
- Втяните зонды, вытащив их из ткани, а затем промойте покрытия водой класса LC-MS, чтобы удалить оставшуюся кровь с поверхности покрытия. Промойте подальше от места операции, и сразу после удаления зондов.
3. Транспортировка и хранение
- Поместите щупы в отдельные флаконы и закройте их.
- Поместите флаконы в коробку из пенополистирола, наполненную сухим льдом или жидким азотом для транспортировки.
- Храните образцы в морозильной камере (-80 °C) или сразу приступайте к этапу десорбции.
4. Десорбция
- Приготовьте десорбционные растворы, состоящие из 80:20 ацетонитрил:вода (v/v) для метаболомного анализа и 1:1 изопропанол:метанол (v/v) для липидомного анализа.
- Пипеткой по 100 мкл раствора во вкладыши помещают в промаркированные флаконы объемом 2,0 мл и помещают по одному зонду, предварительно проколотому через колпачок, в каждый флакон.
- Поместите флаконы на вихревую мешалку и установите скорость перемешивания на уровне 1 200 об/мин в течение 120 минут.
- Извлеките щупы из флаконов. Полученные экстракты теперь готовы к инструментальному анализу.
5. Анализ LC-MS
- Поместите флаконы с экстрактами в автосамплер системы LC-MS.
заметка: Для исследования были использованы жидкостная хроматография (RP, HILIC) в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения и масс-анализатором orbitrap. Для получения информации о параметрах метаболомного анализа перейдите к шагу 5.2. Для получения информации о параметрах липидомного анализа перейдите к шагу 5.6.
- Используйте колонку с пентафторфенилом (PFP) (2,1 мм x 100 мм, 3 мкм) для разделения по обращенным фазам.
- Установите скорость потока на 300 μл/мин, а температуру автосамплера и колонки на 4 °C и 25 °C соответственно.
- Приготовьте подвижные фазы в следующих пропорциях: подвижная фаза А: вода:муравьиная кислота (99,9:0,1, v/v) и подвижная фаза B: ацетонитрил:муравьиная кислота (99,9:0,1, v/v). Установите подвижный фазовый поток в соответствии со следующими параметрами: начальный подвижный фазовый поток (0–3 мин): 100% А, затем линейный градиент до 10% А (3–25 мин), заканчивающийся изократическим потоком 10% А до 34 мин, с последующим 6 мин времени восстановления равновесия колонны.
- Для разделения HILIC используйте колонку HILIC (2,0 мм x 100 мм, 3 мкм, 200 А). Установите расход на 400 μл/мин.
- Готовьте подвижные фазы в следующих пропорциях: подвижная фаза А: буфер ацетаты ацетата ацетата ацетата аммония (9:1, v/v, эффективная концентрация соли 20 мМ).
- Установите подвижный фазовый поток в соответствии со следующими параметрами: начните подвижный фазовый поток (0–3 мин) при 100% А, удерживайте в течение 3,0 мин, а затем увеличивайте до 100% В в течение 5 мин. Удерживайте при 100% В до 12 мин, после чего последует 8 мин времени восстановления равновесия колонны.
- Установите диапазон сканирования 85–1000 м/з. Установите параметры источника ионов HESI в режиме положительной ионизации: напряжение распыления 1 500 В, температура капилляра 300 °C, газ оболочки 40 а.е., расход вспомогательного газа 15 а.е., температура нагревателя зонда 300 °C, уровень S-Lens RF 55%.
- Запускайте пробы контроля качества, состоящие из 10 мкл каждого анализируемого образца (регулярно, каждые 10–12 образцов) для контроля производительности прибора.
- Для разделения по обращенным фазам используйте колонку C18 (2,1 мм x 75 мм, 3,5 мкм).
- Установите скорость потока на 200 μл/мин, а температуру автосамплера и колонки на 4 °C и 55 °C соответственно. Готовить подвижные фазы в следующих пропорциях: подвижная фаза A:H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 мМ ацетата аммония и 1 мМ уксусной кислоты; подвижная фаза B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 мМ ацетата аммония и 1 мМ уксусной кислоты.
- Задайте подвижный фазовый поток по следующим параметрам: 0–1 мин (20% В), 1–1,5 мин (20–50% В), 1,5–7,5 мин (50–70% В), 7,5–13 мин (70–95% В), 13–17 мин (95% В), 17–17,1 мин (95–20% В), 17,1–23 мин (20%).
- Для разделения HILIC используйте колонку HILIC (100 x 2,1 мм, 3 мкм).
- Установите скорость потока на 400 μл/мин, а температуру автосамплера и колонки на 4 °C и 40 °C соответственно.
- Готовьте подвижные фазы в следующих пропорциях: подвижная фаза А:АЦН; подвижная фаза В: 5 мМ ацетата аммония в воде. Задайте подвижный фазовый поток по следующим параметрам: 0–2 мин (96% В), 2–15 мин (96–80% В), 15–15,1 мин (80–96% В), 15,1–21 мин (96% В).
- Установите параметры источника ионов HESI в режиме положительной ионизации на напряжение распыления 3 500 В, температуру капилляров 275 °C, газ оболочки 20 а.е., расход вспомогательного газа 10 а.е., температуру нагревателя зонда 300 °C, уровень S-Lens RF 55%.
- Прогоните пробы контроля качества, состоящие из 10 мкл каждого анализируемого образца (каждые 10–12 образцов) для контроля производительности прибора.
- Сбор данных осуществляется в программном обеспечении, совместимом с прибором.
6. Анализ данных
- Выполнение обработки данных, предполагаемой идентификации и статистического анализа с использованием программного обеспечения, предназначенного для анализа нецелевой метаболомики и липидомики.
заметка: Для визуализации структуры данных можно получить анализ главных компонент (PCA) и графики «коробчатый ус».
