Окрашивание внеклеточной ДНК: метод идентификации внеклеточной ДНК в срезах ткани FFPE

Аннотация

Источник: O'Sullivan, K. M. et al. Контролируемое машинное обучение для полуколичественной оценки внеклеточной ДНК при гломерулонефрите. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео описывает технику окрашивания внеклеточной ДНК в срезах ткани FFPE. Окрашенная внеклеточная ДНК может быть количественно определена для определения эффективности любого терапевтического лечения, которое приводит к гибели раковых клеток.

Протокол

1. Окрашивание на экДНК DAPI и β-актином

1. Поместите стеклянные предметные стекла в решетку для выдвижек в духовку при температуре 60 °C на 60 минут.
2. Погрузите предметные стекла в две замены растворителя (ксилол или заменитель) на 40 минут каждая, в вытяжной шкаф.
3. Регидратируйте в 100% этаноле, 100% этаноле и 70% этаноле в течение 5 минут каждый. Постирать 5 минут в воде из-под крана.
4. Поместите конфорку в вытяжной шкаф и предварительно вскипятите раствор для извлечения антигена (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА pH 9,0) в скороварке. Как только раствор для извлечения антигена начнет кипеть, поместите предметные стекла в кастрюлю горизонтально с помощью щипцов и закройте крышку. Кипятить на высокой мощности (эквивалентно 15 фунтам на квадратный дюйм или 103 кПа) в течение 10 мин.<бр/> заметка: Этот шаг имеет решающее значение, поскольку он извлекает интересующий антиген путем демаскирования эпитопа антигена (сшитого с помощью фиксации формалина) для обеспечения связывания эпитопных антител; Последующее окрашивание без него не получится.
5. Снимите скороварку с огня и немедленно снимите крышку, запустив холодным краном по верхней части крышки в раковине. Оставьте предметные стекла для равновесия на 20 минут в растворе для извлечения антигена.
6. Дважды промыть предметные стекла в течение 5 минут в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS) (pH 7,4) на орбитальном шейкере.
7. Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круги вокруг ткани почек, стараясь не допустить пересыхания тканей за это время.
8. Блокируйте ткань в 10% куриной сыворотке в 5% бычьем сывороточном альбумине (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) в течение 30 мин, 60 мкл на срез. Не мойте после этого этапа, а осторожно удалите блокирующий раствор с помощью пипетки объемом 60 μл, не допускайте пересыхания участков.
9. Применяют первичный коктейль антител для β-актина, разведенного 1/1000 в 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), по 60 мкл на срез и инкубируют в течение ночи в камере влажности при 4 °C.
10. Дважды промыть предметные стекла в течение 5 мин в PBS (pH 7,4, 0,01 M) на орбитальном шейкере.
11. Применяют вторичное антитело, куриное антитело против кролика 488 (1/200), 60 мкл на секцию, разведенную в 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) в течение 40 мин в режиме ЛТ.
12. Промойте предметные стекла дважды в течение 5 минут в PBS (pH 7,4, 0,01 M) на орбитальном шейкере.
13. Погрузите предметные стекла в 0,3% суданский черный в 70% этанол на 30 минут в банку Coplin.
    заметка: Этот шаг важен, так как он гасит автофлуоресценцию, вызванную фиксацией формалина.
14. Промойте предметные стекла в водопроводной воде для удаления осадка, а затем погрузите в PBS (pH 7,4, 0,01 M) на 10 минут, чтобы предотвратить дальнейшее образование осадка Sudan Black.
15. Установите покровные стекла на конфокальные стеклянные покровные стекла с помощью трех капель монтажного раствора по 60 мкл с DAPI и запечатайте покровные стекла лаком для ногтей, нанеся его по всему периметру покровного стекла.
16. Дайте предметным стеклам затвердеть в течение 24 часов при RT (чтобы дать возможность проникнуть DAPI), а затем храните при температуре 4 °C в защищенном от света месте><. заметка: Важно хранить в темноте, чтобы предотвратить выцветание флуоресцентных зондов.
17. Слайды изображения осуществляются с помощью конфокальной лазерной сканирующей головки, прикрепленной к микроскопу. Возбуждайте слайды с помощью лазера 405 для DAPI и лазера 488 для Beta Actin. Захват изображений в одной плоскости 1024 x 1024 пикселей с помощью последовательного захвата строк и 4-строчного усреднения, что необходимо для обнаружения экДНК. Используется масляный объектив 40x 1.0 NA.
    1. Изображение минимум 20 клубочков на образец. Сохраняйте изображения в виде файлов ND2.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А2153	5% и 1% растворы входят в состав PBS, могут быть изготовлены навалом и заморожены - выбросьте после размораживания
Куриное антитело против козьего IgG (H+L) с перекрестной абсорбцией Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	А-21468	Вращайте в мини-центрифуге в течение 1 минуты перед использованием, чтобы избежать свободного конъюгата в коктейле антител
Куриное антитело против мышей IgG (H+L) с перекрестной абсорбцией, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	А-121468	Вращайте в мини-центрифуге в течение 1 минуты перед использованием, чтобы избежать свободного конъюгата в коктейле антител
Куриное антитело против кролика IgG (H+L) с перекрестной абсорбцией Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	А-21441	Вращайте в мини-центрифуге в течение 1 минуты перед использованием, чтобы избежать свободного конъюгата в коктейле антител
Куриные сыворотки	сигма	С5405	Состоит из 1% BSA/PBS
Покровные накладки 24x60 мм	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Это не стандартная толщина, предназначенная для использования в конфокальной микроскопии
ЭДТА 10 мМ	сигма	Е6758	Добавьте TRIS и EDTA вместе в дистиллированную воду и pH до 9 для извлечения антигена, можно составить в 10-кратном растворе
Этанол 30%, 70% и 100%	Поставки химикатов	ООН1170	Поставляется в виде 100% неденатурированного этанола - разбавляется до 30% и 70% с использованием дистиллированной воды
Формальдегид, 4% (10% нейтральный буферизованный формалин)	Траяна	НБФ-500	Почка помещается в пробирку объемом 5 мл, содержащую 3 мл формалина, на 16 часов в режиме лучевой терапии, формалин следует использовать в вытяжном шкафу
Предметные стекла для гистологии - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0мм	Траяна	J3800AM4	Использование предметных стекол с положительным заряженным покрытием имеет важное значение. Мы не рекомендуем использовать поли-L-лизин для покрытия предметных стекол, так как ткань смещается со стекол на этапе извлечения антигена
Антитела к МПО козы против человека/мыши	НИОКР	АФ3667	Аликвот и заморозка при минус 80 градусах по прилету
Гидрофобная ручка	Лаборатория VECTOR	Н-400	Используйте для рисования круга вокруг ткани почек
Фосфатно-солевой буфер	сигма	П38135	0,01M PB/0,09% NaCl Составлять 5 л за раз
Скороварка 6л Tefal secure 5 Neo нержавеющая сталь	Тефаль	GSA-P2530738	Приобретено в местном магазине товаров для дома
Продлить Gold DAPI	Технологии Life	П36962	Наносите капли непосредственно на покровную пленку
Антитела к бета-актину кролика и мыши	АБКАМ	АБ8227	Аликвот и заморозка при минус 80 градусах по прилету
Антитела к H3Cit у кроликов и мышей	АБКАМ	АБ5103	Аликвот и заморозка при минус 80 градусах по прилету
Штатив для окрашивания 24 слайдов	Компания ProScitech	Н4465	Выбранная решетка для окрашивания должна выдерживать кипячение под давлением и инкубацию в духовке при температуре 60 градусов
Судан Блэк Б	сигма	199664	0,3% Добавьте 3 г в бутылку объемом 1 л в 70% этаноле, отфильтруйте и защитите от света - стабильно в течение 6 месяцев при комнатной температуре
Трис 10мМ	сигма	Т4661	Добавьте TRIS и EDTA вместе в дистиллированную воду и pH до 9, для извлечения антигена, можно составить в 10-кратном растворе
ксилол	Траяна	XL005/20	Необходимо использовать в вытяжном шкафу