1. Приготовление реагентов
- Разбавить 5-кратную добавку hiPS клеточной культуры (CCM) в базальной среде hiPS-клеточной культуры с получением 1x раствора hiPS CCM.
заметка: Замороженная добавка 5x hiPS CCM требует медленного процесса размораживания, в идеале при 4 °C в течение ночи. Аликвоты 1x hiPS CCM могут храниться до 6 месяцев при температуре -20 °C.
- Приготовление пластин с покрытием матрицы базальной мембраны (БМ) 1 для культивирования клеток hiPS: Размораживание матрицы БМ 1 в течение ночи на льду при 4 °С. После размораживания приготовьте аликвоты с соответствующими коэффициентами разбавления в соответствии с рекомендациями производителя.
заметка: Как правило, аликвоты готовят для последующего разведения в 25 мл холодного DMEM/F12 в конической пробирке объемом 50 мл с последующим тщательным перемешиванием для полного растворения матрицы BM 1 и исключения образования остаточных кристаллов.
- Перелейте по 1 мл раствора матрицы BM 1 в каждую лунку 6-луночного планшета и инкубируйте при 37 °C в течение 1–2 ч или при 4 °C в течение минимум 24 ч, завернув в парафиновую пленку. Пластины с покрытием BM matrix 1 можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
- Приготовление пластин с покрытием из базальной мембраны (БМ) матрицы 2: Разбавьте соответствующее количество матрицы БМ 2 в 9 мл стерильной дистиллированной воды до получения конечной концентрации 5 мкг/мл. Добавьте 700 мкл раствора матрицы BM 2 в каждую лунку 12-луночного планшета и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 2 ч или в течение ночи при 4 °С.
- Приготовьте по 100 г/мл исходных растворов BMP7, Activin A и VEGF следующим образом: восстановите BMP7 в стерильной дистиллированной воде, содержащей 0,1% (масс./об.) BSA, и восстановите активин А и VEGF отдельно в стерильном PBS, содержащем 0,1% (масс./об.) BSA. Чтобы избежать частых циклов замораживания-оттаивания, приготовьте по 100 мкл аликвот из каждого исходного раствора и храните при температуре -20 °C до 6 месяцев.
- Приготовьте 10 мМ стоковый раствор Y27632, растворив 10 мг Y27632 в 3,079 мл стерильной дистиллированной воды. Аликвоту 100 мкл со склада и хранить при температуре -20 °C до 6 месяцев.
- Растворите 2 мг CHIR99021 в 143,4 мкл стерильного ДМСО для приготовления 30 мМ исходного раствора. Приготовьте 5 мкл аликвот и храните при температуре -20 °C до 1 месяца (или в соответствии с рекомендацией производителя).
- Растворите 10 мг полностью транс-ретиноевой кислоты в 3,33 мл стерильного ДМСО. Приготовьте 500 μL аликвот и храните при температуре -20 °C до 6 месяцев.
2. Подготовка питательных сред
- Приготовьте среду для дифференцировки мезодермы путем восстановления соответствующих исходных растворов до конечной концентрации 100 нг/мл активина А, 3 мкМ CHIR99021, 10 мкМ Y27632 и 1x B27 бессывороточной добавки в соответствующем объеме DMEM/12 с добавкой глутамина><.
заметка: Среда для дифференцировки мезодермы должна быть свежей приготовленной до этапов дифференцировки и в объеме, соответствующем масштабу эксперимента (как правило, 50 мл среды достаточно для двух 12-луночных планшетов).
- Приготовьте промежуточную среду для дифференцировки мезодермы путем восстановления соответствующих исходных растворов до конечной концентрации 100 нг/мл BMP7, 3 мкМ CHIR99021 и 1x бессывороточной добавки B27 в DMEM/F12 с добавкой глутамина.
заметка: При необходимости средство может быть дополнено 1% (об/об) пенициллин-стрептомицина. Отрегулируйте объем среды с помощью DMEM/F12 с добавкой глютамина. Эту среду можно готовить большими партиями; тем не менее, рекомендуется хранить в меньших аликвотах (например, 45 мл в конических пробирках объемом 50 мл), чтобы избежать повторных циклов замораживания-размораживания. Этот носитель можно хранить при температуре -20 °C до 3 месяцев и размораживать при 4 °C в течение ночи перед использованием.
- Приготовьте среду для индукции подоцитов, восстановив до конечной концентрации 100 нг/мл BMP7, 100 нг/мл активина А, 50 нг/мл VEGF, 3 мкМ CHIR99021, 1x бессывороточную добавку B27 и 0,1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты в DMEM/F12 с добавкой глутамина. Защищайте среду от света (например, обернув контейнер фольгированной бумагой).
заметка: Эту среду можно готовить большими партиями и хранить в темноте при температуре -20 °C до 3 месяцев. Замороженные аликвоты следует разморозить в течение ночи при температуре 4 °C перед использованием.
- Приготовьте 25 мл нейтрализующего раствора трипсина, добавив 10% (об/об.) термоинактивированный FBS в DMEM/F12 и отфильтруйте в стерильных условиях.
- Для постдифференцировочной поддержки подоцитов, полученных из стволовых клеток, приготовьте полноценную среду с питательной средой для подоцитов, добавив добавку в базальную среду в соответствии с рекомендациями производителя, и храните при температуре 4 °C до двух недель.
3. Культура клеток hiPS без фидера с использованием среды для культивирования клеток hiPS
- Отсадите остаточный раствор матрицы BM 1 с предварительно покрытых пластин и промойте лунки 3 раза 1-2 мл подогретого DMEM/F12.
- Аспират провел hiPS CCM из клеток hiPS и 3 раза промыл клетки подогретым DMEM/F12. Добавьте 1 мл теплого раствора для отслоения клеток и инкубируйте в течение 1 минуты при 37 °C, чтобы помочь диссоциации клеток. Проведите визуальный осмотр клеток под микроскопом тканевой культуры и убедитесь, что края клеточных колоний кажутся округлыми, затем быстро отсасывайте раствор для отслоения клеток из клеток (убедившись, что клеточные колонии все еще прикреплены к пластине, хотя и неплотно). Аккуратно промойте клетки один раз с помощью DMEM/F12, чтобы удалить раствор для отслоения клеток.
- Добавьте 3 мл hiPS CCM к клеткам hiPS (в каждой лунке 6-луночного планшета), которые были обработаны раствором для отслойки клеток. Соскребите колонии с помощью клеточного подъемника и осторожно пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы выбить слабо прилипшие клетки. Тщательно вымойте пластину, чтобы убедиться, что все клетки собраны.
заметка: Рекомендуется использовать пипетку объемом 5 мл, чтобы избежать чрезмерного сдвига на элементах.
- Перенесите 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку нового 6-луночного планшета с покрытием матрицы BM 1, содержащего 2 мл hiPS CCM на лунку. Переместите планшет в виде восьмерки, чтобы распределить колонии клеток внутри лунок, и инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе с 5 %CO2. Ежедневно обновляйте среду до тех пор, пока клетки не будут готовы к прохождению или использованию для эксперимента по дифференцировке (примерно 70 % конфлюенции).
заметка: Идеальный размер колонии для рутинного пассирования ИПСК составляет от 200 до 500 мкм в условиях без фидера с использованием hiPS CCM (без ингибитора ROCK). Если клетки индивидуализируются во время лечения ферментами диссоциации или буферами, к hiPS CCM можно добавить ингибитор ROCK (например, 10 мкМ Y27632) для улучшения жизнеспособности клеток.
4. Дифференцировка клеток hiPS в клетки мезодермы (дни 0–2)
- В то время как культуры клеток hiPS находятся в фазе экспоненциального роста (примерно в течение 4 дней после посева и около 70% слияния), визуально исследуйте наличие спонтанно дифференцированных клеток внутри и вокруг краев колоний. При необходимости асептически соскребите участки дифференцировки.
- Отсадите hiPS CCM из клеток hiPS и промойте клетки 3 раза теплым DMEM/F12. Инкубируйте клетки с 1 мл буфера для диссоциации клеток, не содержащего ферментов, в течение 10 мин при 37 °C и проверьте диссоциацию под микроскопом. Из-за внутренних различий между различными клеточными линиями hiPS, фактическое время инкубации буфера диссоциации клеток должно быть определено для данной клеточной линии.
- Осторожно соскребите лунку с помощью клеточного подъемника, чтобы выбить слабо прилипшие клетки, и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл, после чего несколько раз проведите пипетирование вверх и вниз для индивидуализации hiPS-клеток.
- Доведите клеточную суспензию до объема 15 мл с помощью теплого DMEM/F12 и центрифугируйте в течение 5 минут при температуре 290 x g при комнатной температуре.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки теплым DMEM/F12 для еще одного раунда центрифугирования для удаления остатков матрицы BM 1 и компонентов диссоциационного буфера.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл индукционной среды мезодермы, как описано выше. Подсчитайте общее количество клеток с помощью гемоцитометра или счетчика сошников, чтобы определить соответствующий объем среды для дифференцировки мезодермы, необходимый для достижения концентрации 1 x 105 клеток/мл.
- Отсадите раствор ECM из матрицы BM на 2-х покрытые пластины и дважды промойте пластины теплым DMEM/F12. Осторожно перемешайте суспензию hiPS-клеток с помощью пипетирования несколько раз. Перенесите по 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 12-луночных планшетов с 2-слойным покрытием матрицы BM, а затем осторожно встряхните пластины, чтобы распределить клетки более равномерно.
- Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2. Освежите среду для индукции мезодермы на следующий день.
заметка: Через 2 дня клетки мезодермы, полученные из клеток hiPS, будут готовы к промежуточной индукции мезодермы.
5. Дифференцировка клеток мезодермы, полученных из клеток hiPS, в промежуточную мезодерму (дни 2–16)
- На 2-й день протокола дифференцировки аспирировать индукционную среду мезодермы и восполнить до 1 мл на лунку промежуточной индукционной среды мезодермы.
- Обновляйте среду каждый день для поддержания точного порога факторов роста и малых молекул для метаболически активных клеток. При значительном росте клеток и быстром истощении питательных веществ среды (о чем свидетельствует пожелтение среды) объем промежуточной среды для дифференцировки мезодермы может быть увеличен до 1,3 мл на лунку 12-луночных планшетов.
- Культивирование клеток в течение дополнительных 14 дней для получения промежуточных клеток мезодермы. К 16-му дню эти клетки могут быть крионированы, чтобы использовать их в дальнейшем.
6. Дифференцировка промежуточных клеток мезодермы, полученных из hiPS-клеток, в подоциты (дни 16–21)
- Промойте промежуточные клетки мезодермы теплым DMEM/F12 с последующей инкубацией клеток с 0,5 мл на лунку 0,05 % трипсина-ЭДТА в течение 3 минут при 37 °C. Проведите визуальный осмотр, чтобы убедиться, что клетки начинают диссоциировать.
- Соскребите клетки с помощью клеточного подъемника и несколько раз нанесите клеточную суспензию с помощью наконечника пипетки объемом 1000 мкл, чтобы получить индивидуализированные (или небольшие скопления) клетки.
заметка: На этом этапе убедитесь, что клетки полностью диссоциированы, так как агрегированные клетки могут не приобрести терминально дифференцированный фенотип в сроки, предусмотренные протоколом.
- Добавьте около 2 мл на лунку нейтрализующего трипсин раствора, чтобы остановить активность трипсина.
- Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и доведите объем до 50 мл с помощью DMEM/F12, а затем центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 минут при 201 x g при комнатной температуре.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в среде индукции подоцитов. Для достижения оптимальных результатов обеспечьте конечную плотность затравки на уровне примерно 100 000 ячеек/лунку 12-луночного планшета. Добавьте суспензию клеток на пластины с покрытием BM matrix 2 и осторожно встряхните пластину, чтобы помочь распределить клетки более равномерно.
- Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 и обновляйте среду ежедневно в течение 5 дней для получения подоцитов к 21,<бр/>
заметка: Полученные подоциты, полученные из клеток hiPS, можно поддерживать в культуре в течение 2–4 дополнительных недель с использованием полной среды с питательной средой для подоцитов. После попадания в среду для поддержания подоцитов клетки можно скармливать через день и использовать для последующих исследований или последующих анализов.