Выделение гладкомышечных клеток Detrusor: процедура ферментативного пищеварения для получения клеток DSM из образцов мочевого пузыря человека

Аннотация

Источник: Malysz, J. et al. Приготовление и использование свежевыделенных гладкомышечных клеток человеческого детрузора для определения характеристик 9-фенантрол-чувствительных катионных токов. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем выделение гладкомышечных клеток детрузора из образцов мочевого пузыря человека с помощью двухэтапной последовательной ферментативной обработки.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Рассечение тканей DSM и подготовка кусочков DSM без слизистой

оболочки

1. Исследуйте образец мочевого пузыря всей толщины, прибывший в лабораторию из операционной, в плотно закрытом контейнере, наполненном раствором для холодной диссекции/сбраживания (Рисунок 1 и Таблица 1 для состава DS).
   заметка: Образец обычно хранится в холодном DS от нескольких часов до ночи до прибытия в лабораторию. Для более длительного хранения к DS (табл. 1) добавляется 1 мМ CaCl₂.
2. Удалите и промойте образец DSM всей толщины человека (содержащий все слои, включая слизистую оболочку, DSM и серозу) ледяным DSM, чтобы смыть прикрепленный мусор и кровь.
3. Прикрепите образец мочевого пузыря слизистой оболочкой вверх и серозой вниз на покрытую силиконовым энантиомером круглую чашку диаметром 150 мм диаметром 150 мм, наполненную ледяным DS (рис. 1B).
4. Удалите из образца прилегающую жировую ткань, кровеносные сосуды, эпителий (уротелий) и слизистую оболочку мышц путем резкого рассечения с помощью микроножниц и щипцов.
5. Вырежьте несколько свободных от слизистой оболочки частей DSM (~2–3 мм в длину и 4–6 мм в ширину) (Рисунок 1C).

2. Ферментативная диссоциация кусочков DSM с получением свежевыделенных одиночных клеток DSM

1. Поместите от 3 до 6 кусочков DSM в пробирку, содержащую от 1 до 2 мл предварительно подогретого (~37 °C) DS, содержащего папаин и дитиотреитол (DS-P, таблица 1), и инкубируйте кусочки DSM в DS-P в течение 30–45 минут при температуре ~37 °C, время от времени осторожно встряхивая пробирку (один раз в 10–15 минут).
   заметка: Для оптимального контроля температуры при ферментативном лечении пробирки с кусочками ткани и растворами ферментов помещаются либо в стеклянную тканевую камеру, заполненную водой, подключенную к циркуляционной водяной бане с подогревом (Рисунок 1D), либо в высокоточную встряхивающую водяную баню с регулируемой температурой (Рисунок 1E).
2. Извлеките DS-P из тюбика, кратко промойте кусочки DSM ледяным DS, выбросьте холодный DS из пробирки, оставив кусочки DSM на дне пробирки.
3. Добавьте от 1 до 2 мл DS-содержащей коллагеназы типа II (DS-C, таблица 1) в пробирку с кусочками DSM; осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 25–40 минут при температуре ~37 °C, осторожно встряхивая пробирку время от времени (каждые 10–15 минут).
4. Выбросьте DS-C и промойте обработанные ферментами кусочки DSM 5–10 раз ледяным DS.
5. После последней промывки оставьте раствор DS внутри пробирки; осторожно разотрите несколько раз отполированной дозатором Пастера, чтобы освободить отдельные ячейки DSM.
6. Поместите несколько капель раствора DS, содержащего диспергированные элементы DSM, на камеру со стеклянным дном или покровную крышку и визуально проверьте качество под микроскопом (с помощью объектива 20x или 40x) по крайней мере через 5 минут после нанесения, чтобы клетки прилипли к дну
.
7. Немедленно используйте свежевыделенные клетки DSM для электрофизиологических экспериментов или храните клетки в пробирке, содержащей DS, при температуре ~4 °C либо на льду, либо в холодильнике до использования (обычно до 8 часов подготовки).
   заметка: В пределах одного и того же препарата качество клеток варьируется от высокожизнеспособных до переваренных, мертвых DSM клеток (рис. 2). Когда последовательный метод папаин-коллагеназы дает очень большое количество нежизнеспособных клеток, препарат отбрасывают и проводят новое разложение кусочков DSM, но с сокращенными интервалами инкубации. Если в результате процедуры получается слишком мало клеток ДСМ, то для последующего переваривания кусочков ДСМ интервалы инкубации увеличивают. Положительная иммунореактивность к α-гладкомышечному актину подтверждает идентичность клеток DSM (рис. 3).

Тип решения	Состав (в мМ)
DS (раствор для вскрытия/разложения)	80 Na-глутамата, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 и 11 глюкозы, pH скорректирован до 7,4 (с 10 M NaOH)
DS-P (папаин-содержащий DS)	ДС, содержащий 1-2 мг/мл папаина, 1 мг/мл дитиотреитола и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина
DS-C (Коллагеназа-содержащий DS)	Раствор DS, содержащий 1-2 мг/мл коллагеназы II типа, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0 или 1 мг/мл ингибитора трипсина и 100-200 мкМ Ca2+
P (пипетка)	110 CsOH, 110 аспарагиновая кислота, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA и 30 CsCl, pH скорректирован до 7,2 с CsOH и дополнен амфотерицином-B (300-500 мкг/мл)
E (внеклеточный)	10 тетраэтиламмония хлорида (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES и 10 глюкозы, pH скорректирован до 7,3-7,4 при NaOH или CsOH и 0,002-3 (2-3 мМ) нифедипина

Таблица 1: Композиции раствора для диссекции/разложения (DS), а также пипетки и внеклеточных растворов, используемых в экспериментах с перфорированным пластырем.

Результаты

Рисунок 1: Краткое описание этапов диссекции, в результате которых были получены кусочки гладкой мускулатуры (ДСМ) и использована установка для ферментативной диссоциации. На рисунке показаны: (А) образец мочевого пузыря человека на всю толщину, полученный в результате открытой операции на мочевом пузыре в качестве постороннего хирургического материала при ледяном ДС...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трубка с круглым дном из полистирола 5 мл	сокол	352054	Пробирки для ДС, содержащие ферменты, используемые на этапах пищеварения
Аналоговый вихревой микшер	ВВР	58816-121
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А7906	ДС
Хлорид кальция	Сигма-Олдрич	С1016	Внеклеточный раствор и DS
ЭГТА	Сигма-Олдрич	Е3889	Хелатор Ca2+, используемый во внутриклеточном растворе для пипеток
глюкоза	сигма	Г8270
Коллагеназа 2 типа	Уортингтонская биохимическая корпорация	LS004177	ДС-С
Гидрат гидроксида цезия	Сигма-Олдрич	С8518	Раствор для внутриклеточной пипетки
CsCl	Сигма-Олдрич	203025	Внеклеточные и внутриклеточные решения
DL-дитиотреитол (ДДТ)	Сигма-Олдрич	D9779	Восстановители, используемые вместе с папаином
НаОХ	Сигма-Олдрич	С8045
Нифедипин	Сигма-Олдрич	Н7634	L-образный блокиратор каналов Ca2+ с потенциал-стробированием
Плавающая подставка/держатель для пенопластовых трубок	VWR Scientific	82017-634	Используется для удержания пробирок с ферментами для контроля температуры
Глутаминовая кислота (соль Na)	Сигма-Олдрич	Г1626	ДС
папаин	Уортингтонская биохимическая корпорация	LS003126	ДС-
MgCl2 (гексагидрат)	Сигма-Олдрич	М2670	Внеклеточные и внутриклеточные решения
KCl	Научный центр Фишера	БП366-1	Внеклеточное решение
NaCl	Сигма-Олдрич	С7653	Внеклеточные и внутриклеточные решения
Игла для шприца неметаллическая, MicroFil	ВПИ	МФ-34Г-5	Наполнение раствора внутриклеточной пипетки
Пастеровская пипетка	ФишерБренд	13-678-20А	Наконечники отламываются, полируются огнем и используются для титрования ферментативно обработанных тканей для высвобождения отдельных клеток DSM из кусочков
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	Н3375	Буфер pH
Водяная баня с встряхиванием Thermo Scientific Precision (модель 2870)	Термо Сайентиал	Прекращено	Водяная баня для контроля температуры ферментативного разложения используется в качестве альтернативы установке тканевой камеры с циркуляцией
Виниловые трубки	Коул Палмер	06405-3	Многоцелевое использование, в том числе для подключения тканевой ванны к водяной бане с циркуляцией
Циркуляционная ванна, Haake D1 L	Хааке	Прекращено	Подключается к тканевой ванне
ZeissAxiovert 40C инвертированный микроскоп с 10-кратным и 40-кратным объективом	Carl-Zeiss	Прекращено	Входит в комплект установки патч-хомута