Амфотерицин-В, опосредованный перфорированным патч-зажимом: электрофизиологический метод изучения ионных токов в клетках мочевого пузыря

Abstract

Источник: Malysz, J. et al. Приготовление и использование свежевыделенных гладкомышечных клеток человеческого детрузора для определения характеристик 9-фенантрол-чувствительных катионных токов. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует характеристику катионных токов от ионных каналов переходного рецепторного потенциала меластатина типа 4 (TRPM4) в гладкомышечных клетках детрузора с использованием метода амфотерицина-B, опосредованного методом перфорированного патч-зажима. Методика помогает оценить биофизические и фармакологические свойства ионных каналов.

Protocol

1. Регистрация токов катиона, индуцированных с шагом напряжения, от ячеек DSM с использованием метода патч-зажима для целых элементов с перфорированным напряжением амфотерицина-B

1. Пипеткой нанесите 0,25–1 мл клеточной суспензии на камеру со стеклянным дном, сидящую на предметном столике инвертированного микроскопа, и дайте клеткам прилипнуть к стеклянному дну.
2. После инкубации в течение не менее 45 минут удалите раствор для сбраживания (DS) из ванны и замените его раствором E (Таблица 1) методом суперфузии, при котором поток раствора под действием силы тяжести через входную трубку медленно заменяет DS новым раствором, в то время как выпускная трубка, подключенная к вакуумному резервуару для отходов, удаляет раствор из камеры и предотвращает переполнение.
   заметка: Раствор Е содержит ионы тетраэтиламмония (^TEA+) и цезия (Cs⁺) для ингибирования токов K⁺.
3. Приготовьте раствор рабочего состава амфотерицина-В в диметилсульфоксиде (ДМСО) (1 мг на 10 мкл ДМСО). Для полного растворения порошка амфотерицина обработать ультразвуком (не менее 15 мин) и хорошо провести вихревой раствор. <бр/> заметка: Этот шаг обычно занимает менее 10 минут. Хорошо работает растворение 3–4 мг амфотерицина-B в 30–40 мкл DSMO в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Более высокие количества амфотерицина-B требуют большего количества растворителя DSMO, что обычно приводит к увеличению интервала смешивания и неполной солюбилизации твердых частиц амфотерицина-B, присутствующих в пробирке.
4. Растворить стоковый раствор амфотерицина-В в растворе пипетки (раствор Р, табл. 1) до получения конечной концентрации 200–500 мкг/мл. На этом этапе требуется обширная ультразвук и вихревая обработка на высокой скорости (8–10/10) в течение ~30–60 минут на каждый шаг для обеспечения оптимального смешивания и предотвращения образования осадка амфотерицина-B в растворе пипетки><. заметка: Амфотерицин-B со временем выпадает в осадок и является светочувствительным. Рабочий раствор пипетки, содержащий амфотерицин-В, проверяют на растворимость, вручную перемешивают перед заполнением пипетки и хранят в темноте.
5. Потяните за несколько патч-электродов, отполируйте наконечники электродов и (при необходимости) покройте наконечники стоматологическим воском.
6. Заполните кончик патч-электрода раствором пипетки (раствор Р, табл. 1) без амфотерицина-В, кратковременно погрузив электрод в раствор.
7. Заполните электрод тем же раствором пипетки, содержащим амфотерицин-В.
8. Установите электрод на держатель, подключенный к головному каскаду усилителя с патч-хомутами.
9. С помощью микроманипулятора поместите электрод чуть ниже поверхности внеклеточного раствора так, чтобы кончик электрода был просто погружен в воду.
10. В режиме удержания напряжения установите удерживающий потенциал на 0 мВ и отрегулируйте ток на 0 пА с помощью диска смещения пипетки на коммерческом усилителе (Таблица материалов).
11. Определите сопротивление электродов с помощью окна/функции «Испытание мембраны» программного обеспечения для коммерческого сбора данных (Таблица материалов). Чтобы активировать, нажмите Инструменты>Мембранный тест>Play или значок ярлыка в программном обеспечении. Определяемое сопротивление электродов должно находиться в диапазоне от 2 до 5 МОм.<бр/> заметка: Функция Membrane Test, предусмотренная в коммерческом программном обеспечении для сбора данных, или опция Seal Test на усилителе могут использоваться для контроля сопротивления электродов путем многократного приложения ступеней напряжения.
12. Продолжайте контролировать сопротивление электрода, продвигая электрод к выбранной ячейке DSM с помощью микроманипулятора (рис. 1A).
    заметка: Чтобы считаться жизнеспособной клеткой DSM, клетка должна иметь веретенообразную удлиненную морфологию, четко выраженный ореол вокруг клетки, четкие края и полусократительный (змеевидный) вид.
13. При прикосновении электродом к поверхности ячейки, о чем свидетельствует быстрое увеличение сопротивления электрода, измеренное с помощью функции Membrane Test, формируйте гигауплотнение, оказывая мягкое быстрое отрицательное давление на держатель электрода через трубки. Это приводит к отрицательному давлению, создаваемому на кончике электрода, который втягивает клеточную мембрану в электрод, способствуя образованию гига-уплотнения или очень плотного контакта между электродом и плазматической мембраной (рис. 1B).
14. После формирования гига-уплотнения компенсируйте емкость пипетки, регулируя быстрые и медленные диски на коммерческом усилителе, и контролируйте стабильность гига-уплотнения (ток утечки) с помощью функции Membrane Test.
15. Дайте время, обычно 30–60 минут, чтобы амфотерицин-B диффундировал вниз по пипетке и был введен в плазматическую мембрану, образуя поры, в первую очередь селективные к одновалентным катионам. На этом этапе продолжайте мониторинг гига-уплотнения с помощью функции Membrane Test. По мере увеличения перфорации ячейки увеличивается и амплитуда емкостных переходных процессов (сравните рисунок 1B с рисунком 1C, показывающий отсутствие и эффективную перфорацию ячейки соответственно), измеренную с помощью функции Membrane Test.
16. Когда перфорация патча оптимальна (если судить по стабильному последовательному сопротивлению, обычно ниже 50 МОм), устраните переходные процессы емкости, отрегулировав диски емкости ячейки и последовательного сопротивления на усилителе. В это время также может быть выполнена компенсация последовательного сопротивления (Рисунок 1D).
17. После того, как наблюдаются стабильные токи катионов, индуцированные действием шага напряжения, вызванные указанным протоколом, примените соединение или физиологическое состояние для испытания методом суперфузии и запишите реакцию для контрольного состояния, условия испытания и вымывания (если это возможно) с помощью коммерческого программного обеспечения для сбора данных.
    1. Записывайте токи с помощью стандартного протокола шага напряжения, который включает в себя удержание ячеек DSM на -64 или -74 мВ и повышение напряжения с шагом 10 мВ в течение 400 или 500 мс от -94 до +96 или +106 мВ и возврат к удерживающему потенциал><у. заметка: Значения потенциала мембраны скорректированы для потенциала перехода жидкости 14 мВ (с использованием растворов P и E, таблица 1). Потенциал перехода жидкости получается в коммерческом программном обеспечении для сбора данных (Table of Materials) путем нажатия кнопки «Инструменты>Потенциалы перехода» и ввода концентраций компонентов ионов раствора. Протокол линейного изменения также может использоваться для получения текущих записей.
    2. Запуск протокола напряжения с непрерывным интервалом ~1 минута во время эксперимента с регистрацией токов для контроля предварительного добавления, условий тестирования и вымывания

Тип решения	Состав (в мМ)
DS (раствор для вскрытия/разложения)	80 Na-глутамата, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 и 11 глюкозы, pH скорректирован до 7,4 (с 10 M NaOH)
DS-P (папаин-содержащий DS)	ДС, содержащий 1–2 мг/мл папаина, 1 мг/мл дитиотреитола и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина
DS-C (Коллагеназа-содержащий DS)	Раствор ДС, содержащий 1–2 мг/мл коллагеназы II типа, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0 или 1 мг/мл ингибитора трипсина и 100–200 мкМ Са2+
P (пипетка)	110 CsOH, 110 аспарагиновая кислота, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA и 30 CsCl, pH скорректирован до 7,2 с CsOH и дополнен амфотерицином-B (300-500 мкг/мл)
E (внеклеточный)	10 тетраэтиламмония хлорида (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES и 10 глюкозы, pH скорректирован до 7,3–7,4 при NaOH или CsOH и 0,002–3 (2–3 мМ) нифедипина

Таблица 1: Композиции раствора для диссекции/разложения (DS), а также пипетки и внеклеточных растворов, используемых в экспериментах с перфорированным пластырем.

Results

Рисунок 1: Схематическое изображение этапов формирования гига-тюленей и перфорации амфотерицина-B клеток DSM человека. На рисунке показано пространственное положение пипетки, содержащей амфотерицин-В, и ячейки DSM, а также связанные с ними ответы на мембранные тесты, полученные в коммерческом программном обеспечении для сбора данных (Таблица материалов) путем изменен...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Трубка с круглым дном из полистирола 5 мл	сокол	352054	Пробирки для ДС, содержащие ферменты, используемые на этапах пищеварения
Амфотерицин-В	рыбак	БП928-250	Используется для перфорации патчей/ячеек
Амфотерицин-В	Стандартные образцы Европейской фармакопеи	5	Используется для перфорации патчей/ячеек
Амфотерицин-В	Сигма-Олдрич	А9528-100МГ	Используется для перфорации патчей/ячеек
Аналоговый вихревой микшер	ВВР	58816-121
Аспарагиновая кислота	Сигма-Олдрич	А9006	Раствор для внутриклеточной пипетки
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А7906	ДС
CaCl2	Сигма-Олдрич	С1016	Внеклеточный раствор и DS
Капиллярное стекло	Саттер	БФ150-110-7,5	Капилляр для препарирования вытянутых накладных электродов
Гидрат гидроксида цезия	Сигма-Олдрич	С8518	Раствор для внутриклеточной пипетки
Программное обеспечение Clampex версии 10 включает в себя программы сбора данных (Clampex) и анализа (Clampfit)	Axon Instruments / Молекулярные приборы	pCLAMP-10	Коммерческое программное обеспечение и часть установки патч-хомута
CsCl	Сигма-Олдрич	203025	Внеклеточные и внутриклеточные решения
Стоматологический воск	Милтекс Дентал Воск Текнолоджиз, Инк.	18058351
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Сигма-Олдрич	Д2650	растворитель
ЭГТА	Сигма-Олдрич	Е3889	Хелатор Ca2+, используемый во внутриклеточном растворе для пипеток
Пылающий/коричневый пуллер для микропипеток	Саттер	-97	Требуется вытягивать электроды с очень тонкими наконечниками
Плавающая подставка/держатель для пенопластовых трубок	VWR Scientific	82017-634	Используется для удержания пробирок с ферментами для контроля температуры
глюкоза	сигма	Г8270
Глутаминовая кислота (соль Na)	Сигма-Олдрич	Г1626	ДС
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	Н3375	Буфер pH
KCl	Научный центр Фишера	БП366-1	Внеклеточное решение
Система сбора данных с низким уровнем шума	Axon Instruments / Молекулярные приборы	Digidata 1440А	Входит в комплект установки патч-хомута
магнитная мешалка	ВВР	01-442-684 (Английский
MgCl2 (гексагидрат)	Сигма-Олдрич	М2670	Внеклеточные и внутриклеточные решения
Микрокузница	Нарисигэ	МФ-830	Используется для электродов для огневой полировки
NaCl	Сигма-Олдрич	С7653	Внеклеточные и внутриклеточные решения
НаОХ	Сигма-Олдрич	С8045
Нифедипин	Сигма-Олдрич	Н7634	L-образный блокиратор каналов Ca2+ с потенциал-стробированием
Инвертированный микроскоп Nikon, TS100 с столиком T1-SM с объективами 5x, 10x, 20x и 40x	Компания Nikon	Прекращено	Входит в состав установки установки патч-хомута
Игла для шприца неметаллическая, MicroFil	ВПИ	МФ-34Г-5	Наполнение раствора внутриклеточной пипетки
Пастеровская пипетка	ФишерБренд	13-678-20А	Наконечники отламываются, полируются огнём и используются для титрования ферментативно обработанных тканей для высвобождения отдельных клеток DSM из кусочков
Усилитель с патч-зажимом	Axon Instruments / Молекулярные приборы	Аксон Аксопатч 200В	Входит в комплект установки патч-хомута
Компьютер ПК	лощина	Пользовательская конфигурация	Входит в комплект установки патч-хомута
pH-метр	Инструменты Aspera	РН700
Полиэтиленовые трубки	Интрамедик	427-436	Трубка для суперфузионной внеклеточной ванны, подключенная к камере со стеклянным дном
Тетраэтиламмония хлорид	Сигма-Олдрич	Т2265	Блокатор ионных каналов каналов Kv и BK добавлен в раствор для внеклеточных ванн
Весы для взвешивания	Mettler Toledo	ХС64
ZeissAxiovert 40C инвертированный микроскоп с 10-кратным и 40-кратным объективом	Carl-Zeiss	Прекращено	Входит в комплект установки патч-хомута