Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные, здоровые мыши дикого типа (WT) (n = 4) и cd44-/- (n = 4) были умерщвлены в возрасте 12−16 недель. Использовались как самцы, так и самки мышей. Все мыши были на фоне C57Bl/6.
1. Вскрытие почки мыши
- Принесите в жертву здоровых мышей WT или генетически измененных мышей в результате вывиха шейки матки.
- Препарируйте целые почки мыши сразу после принесения мышей в жертву. Для этого проводят срединную лапаротомию с помощью ножниц для живота, разрезая кожу, а затем мышцы живота. Удалите кишечник и поместите его рядом с мышкой.
- Освободите почки от соединительной ткани и вытащите почку с помощью хирургических щипцов, разрезая ножницами почечную артерию, почечную вену и мочеточник.
- Удалите почечные капсулы из почек, удерживая почку хирургическими щипцами, и оттяните капсулу с помощью другой пары щипцов.
- Поместите почки в 6-луночный планшет для клеточной культуры (2 почки/лунка), приготовленный из 2 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) на лунку, и положите на лед.
2. Выделение клубочков из почки мыши
- Переложите почки в чашку Петри диаметром 100 мм и измельчите почки на небольшие кусочки размером 1−2 мм с помощью двух скальпелей. Держите кусочки фарша влажными, используя 1−2 мл HBSS.
- Поместите измельченные кусочки почки на металлическое сито толщиной 300 мкм и продавите почку через сито с помощью поршня шприца объемом 20 мл. Несколько раз промойте сито с HBSS между ними и соберите проточный поток в чистую чашку Петри с помощью серологической пипетки. Соберите также все, что осталось/прилипло к нижней стороне сита, соскоблив это скальпелем, и перенесите в собранный поток (гомогенат почек).
- Промойте гомогенат почек через сито 75 мкм с HBSS. Соберите проточный поток и затем промойте его через сито 53 мкм. Промойте оба сита с помощью HBSS, чтобы удалить все мелкие структуры.
заметка: На этом этапе проточный фильтр только промывается, но не продавливается через сито 75 мкм и 53 мкм. Промывка HBSS необходима для удаления мусора и более мелких структур на решетах. Поэтому обычно используется всего 200−300 мл HBSS.
- Соберите структуры/материал почек, оставшиеся на сите размером 75 мкм и 53 мкм, промыв верхнюю поверхность сит модифицированной средой Игла Дульбекко (DMEM) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и перенесите материал в 6-луночный микропланшет со сверхнизким уровнем прикрепления.
заметка: Чтобы промыть верхнюю поверхность сита, промойте сито в наклонном положении (>45°) и соберите материал почки у края сита. Собранный материал обогащают как инкапсулированными, так и декапсулированными клубочками, показывая лишь несколько трубчатых фрагментов. Инкапсулированные клубочки очень липкие. Поэтому для сбора одиночных клубочков важно не допускать прилипания клубочков к поверхности чашки Петри или лунной тарелки. Чтобы избежать прилипания, используйте среду с 20% FCS и используйте пластины со сверхнизким содержанием крепления для этого этапа.
3. Культивирование клубочкового нароста
- Поднесите микропланшет со сверхнизким уровнем крепления к микроскопу с инвертированным светом и соберите одиночные инкапсулированные и/или декапсулированные клубочки с помощью пипетки объемом 20 мкл. Избегайте пипетирования других структур и мусора. После сбора одного клубочка в наконечнике пипетки добавьте свежую среду DMEM без собранного материала почек в тот же наконечник пипетки до объема 20 мкл.
- Перенесите одиночный клубочек со средой DMEM объемом 20 мкл в центр лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток и инкубируйте в течение 3 ч при 37 °C и 5% (v/v)CO2, чтобы обеспечить прикрепление клубочка к центру лунки. Осторожно перемещайте пластину во избежание всплытия клубочка к границам скважины.
- После 3 ч инкубации клубочковый клубок прикрепляют к центру лунки. Осторожно добавьте 500 μL эндотелиальной базальной среды (EBM) с набором факторов роста, содержащим гидрокортизон, фактор роста эндотелия человека, экстракт мозга крупного рогатого скота и гентамицин сульфат-амфотерицин B (Таблица материалов) и дополнительные 5% (v/v) FBS и 1% (v/v) пенициллин/стрептомицин (pen/strep) в каждую лунку.
- Культивировать одиночные клубочки в течение 6 дней при 37 °C, 5% (v/v) CO2,
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 6 дней формируется вырост, состоящий из клеток париетального эпителия. Если вы хотите проверить влияние конкретных соединений или лекарств на париетальные эпителиальные клетки, его следует добавить в среду в течение этого 6-дневного периода.
