$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Имплантация опухоли
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждой мыши имплантируется 1 x 105 MB49-PSA клеток в 50 μл DMEM чистой среды в мочевом пузыре. Из-за мертвого пространства в катетере всегда подготавливайте дополнительный объем (не менее 100 мкл на одну мышь). Альтернативным подходом может быть использование шприца, наполненного воздухом.
- Клетки
- За сутки до имплантации, когда клетки примерно на 80% сливаются, пропустите опухолевые клетки MB49-PSA в полную среду DMEM (с добавлением 10% FBS, 2 ммоль/л L-глутамина, 0,05 мг/мл пенициллин-стрептомицина и 200 мкг/мл гигромицина B) при 37 °C и 5%CO2 в соотношении 1:2.
- В день процедуры соберите клетки, аккуратно соскоблив их стерильным скребком для клеток. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и 0,4% раствор трипанового синего. Подсчитайте живые клетки с помощью гемоцитометра. Не имплантируйте, если более 20% клеток мертвы.
- Рассчитайте необходимое количество живых клеток (2 x 10,6 клеток/мл) и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 250 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в чистом материале DMEM. Повторите промывание три раза, чтобы удалить все следы FBS перед имплантацией.
- Держите клеточную суспензию на льду до тех пор, пока мыши не будут готовы к имплантации.
- Дайте 4-6-недельным самкам мышей C57BL/6J акклиматизироваться в течение одной недели перед процедурой. Все работы с животными должны выполняться в шкафу биологической безопасности для поддержания стерильных условий.
- Взвесьте каждую мышь и введите анестезиологическое введение (75 мг/кг кетамина и 1 мг/кг медетомидина) внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл на 10 г массы тела. Масса тела должна составлять от 17 до 22 г. Подтвердите обезболивание, не наблюдая никакой реакции после защемления пальца ноги.
- Для идентификации отметьте ухо с помощью ушного прокола.
- Вводите раствор Гартмана или сложный лактат натрия внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл на 10 г массы тела каждые 1–2 ч для гидратации.
- Нанесите стерильную офтальмологическую мазь на оба глаза с помощью стерильной ватной груши, так как под наркозом теряется мигающий рефлекс и глаза пересыхают. При необходимости нанесите повторно.
- Положите мышей в лежачем положении на бумажных полотенцах поверх теплового пакета (активируемого при контакте с воздухом) для поддержания температуры тела и задних лап вниз.
- Пальцем слегка надавите на нижнюю часть брюшной полости и соберите мочу из мочевого пузыря в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Этот образец служит базальным значением ПСА в моче.
- Извлеките стерильный поли-L-лизин (ФАПЧ) в шприц объемом 1 мл и прикрепите внутривенный катетер 24-го калибра, удалив игльный стилет. Нанесите смазку на кончик катетера и введите катетер через мочеиспускательный канал в мочевой пузырь с помощью щипцов для проведения катетеризации. Остановитесь, когда почувствуете сопротивление.
Примечание: Исследователи должны обсудить со своим ветеринарным персоналом необходимость использования смазывающего геля с анестетиком для внутрипузырных инстилляций и использования обезболивающих средств после процедуры.
- Закапывайте 50 мкл ФАПЧ медленно, со скоростью 10 мкл каждые 20 с, чтобы избежать пузырно-мочеточникового рефлюкса. Оставьте катетер в мочевом пузыре на 20 минут с пробкой, чтобы предотвратить отток.
- Через 20 минут извлеките катетер и освободите мочевой пузырь от любого содержимого, слегка надавливая на нижнюю часть живота. С помощью пустого шприца объемом 1 мл смойте оставшееся содержимое из катетера.
- Тщательно перемешайте клетки MB49-PSA с помощью пипетирования и извлеките их в шприц объемом 1 мл. Подсоедините катетер и нанесите лубрикант. Закапывайте 50 мкл 1 x 105 клеток с медленной скоростью 10 мкл каждые 20 с. Установите на место пробку на катетере. Дайте контрольным мышам 50 мкл физиологического раствора.
- Через 1 ч извлеките катетеры и освободите мочевой пузырь от любого содержимого. Снимите ленту с задних лап и поместите мышей на их брюшные стороны. Реанимировать мышей путем подкожного введения обратного препарата (1 мг/кг атипамезола) в дозе 0,1 мл на 10 г массы тела.
- Наблюдайте за мышами до тех пор, пока не будет замечена подвижность. Верните мышей в клетки.