Получение раковых сфероидных блоков методом мгновенной заморозки: процедура сохранения раковых сфероидов в замороженных матричных блоках

Аннотация

Источник: Wang, Y. et al. 3-D Система клеточных культур для изучения инвазии и оценки терапевтических средств при раке мочевого пузыря. J. vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует подготовку раковых сфероидальных блоков методом мгновенной заморозки, методом, при котором интересующий образец ткани замораживается до ультрахолодной температуры, удерживая сфероиды внутри матрицы.

Протокол

1. Подготовка образца блока, содержащего раковые сфероиды, для среза замороженной ткани

1. Аккуратно поднимите блок коллагенового геля и сфероидов с камерных горок с помощью небольших щипцов. Поместите блок коллагенового геля в пластиковую гистологическую форму.
2. Кратковременно промойте коллагеновый гель 1x PBS, а затем закрепите его 4% параформальдегидом (PFA) в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
   заметка: PFA является потенциальным канцерогеном, и с ним следует обращаться с осторожностью.
3. Смойте коллагеновый гель 1,5 мл 1x PBS на шейкере в течение 15 мин. Замените PBS и повторите предыдущий шаг умывания 3 раза.
4. Нанесите тонкий слой (около 3 мм) состава для оптимальной температуры резки (OCT), чтобы покрыть дно новой пластиковой гистологической формы. Поместите фиксированный и промытый коллагеновый гель поверх ОКТ-соединения, затем осторожно заделайте весь гель, заполнив форму ОКТ-компаундом, избегая при этом образования пузырьков воздуха в ОКТ.
5. Оставьте форму при температуре 4 °C на 1 час.
6. Поместите форму, содержащую образец и ОКТ-соединение, на чашку Петри диаметром 100 мм, плавающую на жидком азоте. Дайте образцу полностью застыть.
7. Храните замороженный блок образца при температуре -80 °C для использования в будущем.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среда для культивирования клеток DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Фетальная бычья сыворотка	Thermo Fisher Scientific	26140079
Антибиотик-антимикотик (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	А3803
Фосфатно-солевой буфер (PBS), рН 7,4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Коллаген 1 типа из крысиного хвоста, high концентрация	Корнинг	354249
Nunc Lab-Tek II Chambered Покровное стекло	Thermo Fisher Scientific	155382
Раствор параформальдегида	Науки электронной микроскопии	15710
Соединение O.C.T	Thermo Fisher Scientific	23730571