Доставка ДНК-плазмид в уротелий мочевого пузыря мыши: процедура на основе электропорации для эффективной доставки ДНК-плазмид в уротелиальные клетки мышиного мочевого пузыря для создания генетически модифицированных моделей

Аннотация

Источник: Chuan, Y. et al. Новый метод доставки плазмидной ДНК в уротелий мочевого пузыря мыши с помощью электропорации. J. Vis. Exp.(2018)

Это видео демонстрирует доставку плазмиды ДНК в уротелий мочевого пузыря мыши с использованием комбинации методов катетеризации уретры и электропорации. Описанная процедура позволяет создавать модели рака мочевого пузыря мышей.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка плазмид и инструментов

1. Для каждого мочевого пузыря для трансфекции необходимо подготовить не менее 20 мкл ДНК-плазмиды (1 мкг/мкл).
2. Добавьте 1 μL Trypan Blue к 20 μL раствора плазмиды в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Пипеткой хорошо перемешать.
3. Автоклавируйте все хирургические инструменты и простерилизуйте рабочее место с помощью 70% этанола. Часто распыляйте на хирургические инструменты и перчатки 70% этанол или используйте стерилизатор со стеклянными шариками при выполнении следующих действий для поддержания стерильных условий.

2. Доставка плазмид

1. Нанесите 70% этанол на живот мыши, находящейся под наркозом, и с помощью скальпеля сделайте вертикальный разрез на 1 см, чтобы открыть кожу живота над мочевым пузырем.
2. Нанесите пипеткой не менее 20 мкл плазмиды плюс раствор Trypan Blue на внешний конец катетера и прикрепите шприц.
3. Введите раствор плазмиды в мочевой пузырь. Если мочевой пузырь посинел, инъекция прошла успешно. Оставьте немного жидкости в катетере, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в мочевом пузыре.
4. Захватите наружное отверстие уретры с помощью пинцета, а затем извлеките катетер и шприц. С помощью шнура затяните наружное отверстие уретры. Сделайте две петли с помощью веревки, а затем завяжите двумя узлами.
   заметка: Уплотнение уретры важно для предотвращения обратного тока плазмидной жидкости.
5. Включите электропорационный генератор со следующими параметрами: 33 В, время работы 50 мс и интервальное время 950 мс.
6. Зажмите мочевой пузырь пинцетом и зажмите мочевой пузырь двумя электродами. Нажмите на ножную педаль, чтобы выполнить электропорацию.
   заметка: Электрические импульсы настроены на 5 раз с короткими интервалами после каждого нажатия на педаль. В этом процессе мышь может дергаться. Нажатие на ножную педаль более одного раза может повысить эффективность доставки, но слишком большое количество электрических импульсов может повредить целостность тканей уротелия.
   1. Избегайте любого контакта между пинцетом и электродами, так как это приведет к образованию искры.

3. Восстановление

1. Зашивайте брюшную полость и отверстие кожи стерильными хирургическими швами и клипсами. Нанесите йод на рану.
2. Извлеките животное из системы изофлурана. Вводите анальгетик бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно для облегчения послеоперационной боли.
3. Держите животное на грелке и верните его в домашнюю клетку после полного выздоровления. Проверяйте животное не реже одного раза в день на предмет нормальной подвижности, питья и пищевого поведения, а также отсутствия признаков инфекции до тех пор, пока разрез не заживет, а затем снимите зажимы. Проводите последующие инъекции анальгетика бупренорфином, если животное проявляет болевые симптомы, такие как снижение груминга, повышенная агрессивность и вокализация.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц BD 1 мл TB	рыбак	148232Э
Бупренорфин	сигма	Б9275-50МГ
Пинцет Дюмон	Роботизированная хирургическая инстракция	РС-5005	Обработайте 70% этанолом перед хирургическим применением
ECM830 SQ волновой электропоратор	Гарвардский аппарат	450052
Exel International Одноразовые катетеры Safelet для внутривенных катетеров	Научный центр Фишера	Тел.: 14-841-21	24G, длина 2,11 см, внешний диаметр 0,045 см
Сверхтонкие ножницы для микродиссекции	Роботизированная хирургическая инстракция	РС-5135	Обработайте 70% этанолом перед хирургическим применением
Изофлуран	Ветеринар один	501017
K&H Коврик для отдыха мелких животных с подогревом, 9 на 12 дюймов	амазонка		Накройте тепловый коврик бумажными полотенцами
Офтальмологическая мазь	рыбак	NC0849514
PBS, pH 7,4	Технологии Life	10010049
Наконечники для пипеток 200 мкл	США Сайентифик	1111-0206 (Английский)
Наконечники для пипеток, Universal Fit; от 0,1 до 10 μл	рыбак	02707438(КС)
ПИПЕТМАН NEO P2	Гилсон	F144561
ПИПЕТМАН NEO P200N	Гилсон	F144565
плазмида CAG-GFP	Адджен	16664
Платиновый пиццертрод 5 мм	Гарвардский аппарат	450489	Диаметр 5 мм
ножницы	Роботизированная хирургическая инстракция	РС-5880	Обработайте 70% этанолом перед хирургическим применением
Струнный шнур	амазонка		Мандала Crafts 150D 210D 0,8 мм 1 мм кожа шитье плоская вощеная нить шнурок шнур
Скотч, скотч	рыбак	19047257
Ветеринарная смазка Therio-gel	Здоровье животных PBS	353-736 (Английский)
Трипановая синяя морилка	Технологии Life	15250061
V-1 Настольная система анестезии	ВетЭкип	901806
Викрил фиолетовый шовный 18" FS-2 резка 5-0	рыбак	NC0578475
Walgreens Повидон Йод 10%	Грецкие орехи	953982
Зажим для раны	рыбак	18045
Аппликатор зажимов для ран	рыбак	1804 г

г. .