Выделение экзосом: метод ультрацентрифугирования на основе плотности с использованием подушки сахарозы для отделения экзосом от кондиционированных сред культивируемых клеток

Аннотация

Источник: Faruqu, F. N. et al. Подготовка экзосом для доставки миРНК в раковые клетки.J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается метод ультрацентрифугирования на основе плотности для выделения экзосом из кондиционированной среды, собранной из культур эмбриональных клеток почек человека с использованием 25% (w/w) сахарозной подушки, приготовленной в оксиде дейтерия. Выделенные экзосомы могут быть использованы для последующих применений.

Протокол

1. Выделение экзосом на подушке из сахарозы

1. Предварительно очистите собранную кондиционированную среду (CM) с помощью дифференциального центрифугирования и фильтрации следующим образом.
   1. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. Перелейте надосадочную жидкость в новую пробирку и выбросьте гранулы. Повторите этот этап центрифугирования еще раз, восстановив надосадочную жидкость и выбросив гранулу.
   2. Центрифугируйте надосадочную жидкость на стадии 1.1 при 2 000 x g в течение 15 мин и 4 °C, а затем выбросьте гранулы. Восстановившуюся надосадочную жидкость отфильтруйте один раз через фильтры 0,22 мкм.
2. Во время предварительной очистки приготовьте 25% (масс./вес) раствор сахарозы в оксиде дейтерия, точно отвесив 1,9 г (± 0,001 г) сахарозы в универсальной пробирке, а затем доливая оксид дейтерия до тех пор, пока масса не достигнет 7,6 г (± 0,001 г).
3. Наполните ультрацентрифужную пробирку (см. Таблицу материалов) 22,5 мл предварительно очищенного CM. Заполните CM до 22,5 мл фильтруемым PBS 0,22 мкм, если текущий объем меньше этого.
4. Поместите в пробирку стеклянную пипетку (см. Таблицу материалов) и через нее добавьте 3 мл раствора сахарозы так, чтобы раствор образовал отдельный слой под КМ.
5. Осторожно поместите пробирку, содержащую слоистый раствор КМ/сахарозы, в ведро поворотного ротора (см. Таблицу материалов) и закрепите ведро в роторе.
6. Поместите ротор в ультрацентрифугу (см. Таблицу материалов) и вращайте при 100 000 x g в течение 1,5 ч при 4 °C.
7. Соберите 2 мл слоя сахарозы и добавьте его в ультрацентрифугу (см. Таблицу материалов), содержащую 20 мл отфильтрованного PBS для этапа промывки.
8. Поместите трубки в ротор с фиксированным углом наклона (см. Таблицу материалов) и вращайте при температуре 100 000 x g в течение 1,5 ч при 4°C.
9. Осторожно удалите надосадочную жидкость серологической пипеткой объемом 10 мл и повторно суспендируйте гранулу фильтрованным PBS в объеме 400 мкл. Храните этот запас экзосом при температуре 4 °C или -80 °C для краткосрочного и долгосрочного хранения соответственно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
сахароза	Научный центр Фишера	С/8600/60	1 кг
Оксид дейтерия (D2O)	Сигма-Олдрич	151882	250 г
1X Фосфатный буферный раствор	Thermo Fisher Scientific	10010015	500 мл
Millex-GP Шприцевой фильтрующий блок 0,22 мкм	Многородность	SLGP033RS
ультрацентрифуга	Бекман Коултер	Оптима ХПН-80
Поворотно-откидной ротор	Бекман Коултер	SW45 Ti
Ротор с фиксированным углом наклона	Бекман Коултер	Тип 70 Ti
Ультрацентрифужные пробирки	Бекман Коултер	355631	Поликарбонат. Макс. наполнитель 32 мл
Ультрацентрифужные бутылки	Бекман Коултер	355618	Поликарбонат. мин. наполнение 16 мл, макс. наполнение 25 мл
центрифуга	Эппендорф	5810Р
Стеклянные пипетки	Научный центр Фишера	1156-6963 (Английский)
25% с сахарозой			Добавьте 1,9 г (± 0,001 г) сахарозы в универсальный тюбик, и долейте D2O, пока вес не достигнет 7,6 г (± 0,001 г). Это составляет ~6 мл 25% безмасляной подушки с сахарозой.