$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Тканевая обработка и выделение первичных канальцевых клеток
- Извлеките почечные капсулы и мозговое вещество, измельчите обе почки на мелкие кусочки и инкубируйте их в 10 мл буфера для пищеварения в духовке при температуре 37 °C при осторожном вращении в течение 5 минут.
- Удалите все непереваренные ткани почек, пропустив буфер через фильтр 70 мкм. Добавьте 10 мл питательной среды, чтобы остановить переваривание.
- Для сбора трубчатых клеток центрифугируйте отфильтрованную клеточную суспензию при давлении 50 х г в течение 5 мин для сбора первой гранулы. Переложите надосадочную жидкость в новую пробирку и добавьте 5 мл питательной среды, центрифугируйте при 50 x g в течение 5 минут, чтобы убедиться, что все трубчатые клетки собраны во вторую гранулу. Центрифугирование происходит на более низкой скорости, в первую очередь для гранулирования тяжелых трубочек. Позже, после того как клетки восстанавливаются после выделения, чистую трубчатую культуру центрифугируют с более высокой скоростью во время субкультур.
- Суспендируйте первую гранулу в 20 мл питательной среды и центрифугируйте ее при 50 x g в течение 5 минут для сбора третьей гранулы.
- Вторую и третью гранулы ресуспендировать в 1 мл питательной среды. Смешайте 10 μL клеточной суспензии с 10 μL Trypan Blue, загрузите смесь в камеру A счетного стекла и запишите жизнеспособность клеток с помощью автоматического счетчика клеток.
- Засейте до 107 клеток (гетерогенная популяция) на одну чашку диаметром 60 мм, предварительно покрытую коллагеном, и дайте трубчатым клеткам прикрепиться на ночь.