$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Периодическое окрашивание кислотой Шиффа (PAS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание PAS выделит базальные мембраны клубочковых капиллярных петель и трубчатый эпителий. Он позволяет детально визуализировать клубочковые клетки, мезангиальный матрикс и потенциальное расширение, а также потенциальные изменения GBM (т.е. утолщение и неровности).
- С помощью микротома толщиной 5 мкм с помощью микротома толщиной 5 мкм на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином, залитая парафином, фиксированная PFA. Сушить при 37 °C в течение 1 часа. Убедитесь, что на срезе нет складок или отверстий, которые могут исказить морфологию под микроскопом.
- Депарафинизируйте предметные стекла путем двукратной инкубации в ксилоле (ОСТОРОЖНО, раздражителен; используйте в вытяжном шкафу) в течение 3 мин каждого, дважды в 100% EtOH в течение 3 мин каждая, а затем один раз в 95%, 70% и 50% EtOH в течение 3 мин каждая, все при комнатной температуре. Регидратируйте предметные стекла в dH2O.
- Инкубируйте предметные стекла в периодическом растворе кислоты (ОСТОРОЖНО, раздражающее; используйте в вытяжном шкафу) (1 г/дл) в течение 5 минут, а затем промойте предметные стекла в нескольких сменах dH2O. Используйте контейнер со 100 мл dH2O при комнатной температуре.
- Инкубировать предметные стекла в реагенте Шиффа (паразоанилин гидрохлорид 6 г/л и метабисульфит натрия 4% в HCl 0,25 моль/л) в течение 15 минут при комнатной температуре. Промойте горки в проточной воде из-под крана в течение 5 минут.
- Противоморочное пятно гематоксилином в течение 3 секунд перед тщательным промыванием стекол в проточной водопроводной воде в течение 15 мин.<бр/>
заметка: Для определения оптимального времени окрашивания гематоксилином может потребоваться некоторая оптимизация.
- Обезвоживайте слайды с использованием протокола, обратного протоколу депарафинизации. Отделаем ксилолом.
- Сухие направляющие на воздухе и крепление с помощью монтажного материала на основе ксилола.
- Изображение на световом микроскопе с 400-кратным увеличением для оценки клубочковых структур. Оцените: утолщение и неровности ГБМ, коллапс капиллярных петель, фиброзную ткань, склероз, клеточную пролиферацию (эндотелиальные, подоцитарные и мезангиальные или воспалительные клетки, инфильтрирующие хохолок).
заметка: Для всесторонней оценки патофизиологии клубочков следует оценить поражения в других частях почки, например, в канальцах.