Периодическое окрашивание кислотой по Шиффу или PAS: метод оценки структурных деформаций клубочков

1. Периодическое окрашивание кислотой Шиффа (PAS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание PAS выделит базальные мембраны клубочковых капиллярных петель и трубчатый эпителий. Он позволяет детально визуализировать клубочковые клетки, мезангиальный матрикс и потенциальное расширение, а также потенциальные изменения GBM (т.е. утолщение и неровности).

1. С помощью микротома толщиной 5 мкм с помощью микротома толщиной 5 мкм на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином, залитая парафином, фиксированная PFA. Сушить при 37 °C в течение 1 часа. Убедитесь, что на срезе нет складок или отверстий, которые могут исказить морфологию под микроскопом.
2. Депарафинизируйте предметные стекла путем двукратной инкубации в ксилоле (ОСТОРОЖНО, раздражителен; используйте в вытяжном шкафу) в течение 3 мин каждого, дважды в 100% EtOH в течение 3 мин каждая, а затем один раз в 95%, 70% и 50% EtOH в течение 3 мин каждая, все при комнатной температуре. Регидратируйте предметные стекла в dH₂O.
3. Инкубируйте предметные стекла в периодическом растворе кислоты (ОСТОРОЖНО, раздражающее; используйте в вытяжном шкафу) (1 г/дл) в течение 5 минут, а затем промойте предметные стекла в нескольких сменах dH₂O. Используйте контейнер со 100 мл dH₂O при комнатной температуре.
4. Инкубировать предметные стекла в реагенте Шиффа (паразоанилин гидрохлорид 6 г/л и метабисульфит натрия 4% в HCl 0,25 моль/л) в течение 15 минут при комнатной температуре. Промойте горки в проточной воде из-под крана в течение 5 минут.
5. Противоморочное пятно гематоксилином в течение 3 секунд перед тщательным промыванием стекол в проточной водопроводной воде в течение 15 мин.<бр/> заметка: Для определения оптимального времени окрашивания гематоксилином может потребоваться некоторая оптимизация.
6. Обезвоживайте слайды с использованием протокола, обратного протоколу депарафинизации. Отделаем ксилолом.
7. Сухие направляющие на воздухе и крепление с помощью монтажного материала на основе ксилола.
8. Изображение на световом микроскопе с 400-кратным увеличением для оценки клубочковых структур. Оцените: утолщение и неровности ГБМ, коллапс капиллярных петель, фиброзную ткань, склероз, клеточную пролиферацию (эндотелиальные, подоцитарные и мезангиальные или воспалительные клетки, инфильтрирующие хохолок).
   заметка: Для всесторонней оценки патофизиологии клубочков следует оценить поражения в других частях почки, например, в канальцах.