Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выполните гидродинамическую операцию по инъекции почечной лоханки
- Тщательно отбирайте мышей для хирургического вмешательства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различий в зависимости от штамма пока не наблюдалось, но они возможны. Большинство впрысков было выполнено на фоне C57BL/6 или FVB. Инъекции в почечную лоханку лучше всего работают у мышей в возрасте 6–12 недель. У мышей старше 16 недель по неясным причинам возможен до 50% неудач при визуализации люциферазы. Такая же возрастная частота неудач наблюдалась при гидродинамических инъекциях в печень из хвостовой вены, поэтому это может быть общим ограничением, относящимся к принципу гидродинамической инъекции. В том же духе другие показали, что гидродинамическая инъекция хвостовой вены в фиброзную печень крысы не так эффективна, как здоровая печень, поэтому возможно, что в условиях почечного фиброза гидродинамическая инъекция почечной лоханки не будет столь эффективной, но это не было проверено напрямую.
2. Подготовка мышей и ДНК-шприцев к операции
- Обезболите мышей кетамином и ксилазином.
- Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, необходимые для содержания животных, такие как одноразовый лабораторный фартук, хирургическая маска для лица и нитриловые перчатки.
- Работая с 2–4 мышами одновременно, взвесьте каждую мышь в пластиковом стакане объемом 500 мл на весах с точностью до 0,1 г. Рассчитайте правильное количество кетамина 24 мг/мл и 2 мг/мл ксилазина, разведенных в обычном 0,9% физиологическом растворе, для введения каждой мыши путем внутрибрюшинной инъекции (см. упомянутое видео для получения дополнительной информации о внутрибрюшинной инъекции). Используйте формулу (50 μL + ((5 μL) x (вес (г)) или рассчитайте по другой формуле после консультации с местной ветеринарной бригадой и IACUC.
- Вводите мышь путем внутрибрюшинной инъекции стандартными методами. Поместите мышь в ведро для бумаги до тех пор, пока мышь не станет неподвижной.
Мыши, готовые к операции, готовы к операции, когда они больше не реагируют на тест на защемление пальцев ног. Дайте мышам, которые продолжают реагировать на тест с щипцом ноги, через 20–30 минут после первоначальной инъекции на 20–60 мкл больше анестетика, в зависимости от силы ответа.
- Поместите мышь на грелку с циркуляцией воды, покрытую синей подушечкой, и закапывайте ветеринарную мазь в оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Выбрейте левую сторону задней части мыши от плеча до крупа и от боковой части до позвоночника с помощью бритвы, предназначенной для ухода за домашними животными. Удалите выпавшие волосы и мусор.
- Приготовьте отдельный шприц, содержащий 100 мкл разбавленной ДНК, для каждой мыши, находящейся под наркозом, следя за тем, чтобы в ней не было пузырьков воздуха.
- Используйте стерильный инсулиновый шприц U-100 29G x 1/2" объемом 0,5 мл со стационарно прикрепленной иглой без предохранителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тип шприца имеет решающее значение. Этот манометр обеспечивает быстрый впрыск. Постоянно прикрепленная игла предотвращает вытекание раствора. Наличие предохранителя будет препятствовать доступу к почечной лоханке. Шприцы, указанные в таблице материалов, скользят более равномерно во время инъекции, чем другие протестированные бренды.
- Загрузите шприц до ~120 мкл и потяните поршень вниз, чтобы создать пространство в верхней части. Постукивайте ручкой, пока все пузырьки воздуха не поднимутся наверх. Удерживая иглу вверх, осторожно нажмите на поршень, чтобы удалить весь воздух, пока на кончике иглы не образуется капля. Не должно быть никаких видимых пузырьков, так как они могут вызвать воздушную эмболию, которая убьет животное.
- Закончите нажатие на поршень до тех пор, пока в шприце не останется 100 μл, вылив излишки раствора ДНК в исходную микрофуговую пробирку. При необходимости тщательно промаркируйте и поместите загруженные шприцы на стерильную простыню для поддержания стерильности, если помещение, где проводятся работы, не позволяет закупорить иглы.
3. Выполните инъекционную операцию
- Подготовьте место для операции. Наденьте стерильную простыню на грелку и вылейте стерильные хирургические инструменты на стерильную простыню, не касаясь их. Возьмите в руки мышь и поместите ее в поле зрения. Отрегулируйте освещение так, чтобы оно освещало территорию.
- Извлеките из упаковок три тампона с антисептиком 3,15% хлоргексидина глюконата и 70% изопропилового спирта и положите рядом с животным.
- Переоденьтесь в стерильные хирургические перчатки. Работая круговыми движениями, начиная с места разреза, трижды промокните животное новым тампоном с хлоргексидином/спиртом.
- Найдите место разреза, как показано на рисунке 1A. Защипывая кожу пинцетом, с помощью ножниц сделайте надрез до слоя кожи примерно в 1 см от позвоночника и ниже грудной клетки. Как только длина места пореза достигнет примерно 1 см, сделайте аналогичный участок ниже, в мышечном слое.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте разрез нужной длины, чтобы почка едва прошла через разрез, а затем удерживалась на месте самим разрезом. Слишком маленький разрез и почка не может быть оголена; Слишком большой почка будет постоянно соскальзывать обратно в брюшную полость.
- Найдите почку.
заметка: Он может быть заметен среди белой жировой ткани. Селезенка также расположена с левой стороны животного. Цвет этих органов можно визуально дифференцировать, так как селезенка темно-бордового цвета, а почка – темно-красно-оранжевого. Не желательно проводить манипуляции с селезенкой, так как она может быть легко разорвана.
- Не касаясь почки, аккуратно обнажите ее из брюшной полости, оказывая постоянное, мягкое давление пальцами на живот (рисунок 2В). Используйте закрытый пинцет, чтобы при необходимости аккуратно протолкнуть нежелательные органы обратно в брюшную полость. Не используйте открытые щипцы, так как это может повредить почку или другие органы.
- Как только почка выйдет из брюшной полости, аккуратно отделите ее от окружающего жира ровно настолько, чтобы визуализировать почечную лоханку, маленькую белую точку (рис. 1B). Отодвиньте лишний жир в сторону или удалите при необходимости. Ни в коем случае не удаляйте надпочечник, расположенный возле верхнего полюса почки, или почечную капсулу.
- С помощью закрытых щипцов надавить вниз на правую сторону почки так, чтобы почечная лоханка оставалась в поле зрения, возьмитесь правой рукой за загруженный инсулиновый шприц и держите его параллельно рабочей поверхности иглой, направленной на почечную лоханку (рисунок 2Е). Осторожно введите иглу в почечную лоханку иммобилизованной почки, как показано на рисунке 1В.
- Введите раствор быстро в течение трех секунд. Около трети почки может осветлиться и изменить цвет на белый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно наблюдается скопление жидкости в капсуле почки после инъекции, а также образование гематомы. Некоторые повреждения необходимы для достижения достаточного уровня трансфекции ДНК для обнаружения.
- Удерживайте иглу на месте в течение примерно 10 секунд, чтобы предотвратить обратный поток раствора. Затем аккуратно и медленно извлеките иглу. Вернуть орган в брюшную полость, аккуратно растянув место разреза и используя закрытые щипцы.
- Сшить мышечный слой животного 5–0 рассасывающимися нитями, поставив 2–4 самостоятельных узла.
- Сшить слой кожи животного 5-0 или 6-0 нерассасывающимися нейлоновыми нитями, поставив 2–4 независимых узла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты можно использовать повторно после помещения в стерильную ванну с шариками и охлаждать.
