$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Имплантация клеток
Чтобы имплантировать клетки Renca внутрипочечно, приготовьте клетки Renca в одноклеточную суспензию со скоростью 2 x 106 клеток/мл в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS).
- Удалите адгезивные клетки Renca из колбы для культуры тканей с помощью 0,25% трипсина в HBSS. Через ~5 минут добавьте полный RPMI в колбу, чтобы нейтрализовать трипсин, и перенесите клетки в центрифужную пробирку для промывки. Центрифугируйте элементы при относительной центробежной перегрузке 300 (rcf x g) в течение 5 мин при 25 °C.
- Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в HBSS. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и отрегулируйте объем с помощью HBSS так, чтобы получить 2 x 106 клеток/мл.
- Наберите клетки в шприц объемом 1 мл с иглой 18-го калибра, чтобы предотвратить напряжение сдвига на клетках. Перед введением опухолевых клеток замените иглу 18-го калибра на иглу 28-го калибра. Инъекция 0,1 мл доставляет 2 x 105 клеток в почку.
2. Подготовка хирургической области
- Подготовьте стерильную операционную зону в шкафу биобезопасности, положив стерильную хирургическую простыню на грелку. Соберите все необходимое, включая щипцы, скальпель, ножницы, глазные капли, 5% антисептик повидон-йод и стерильную марлю. Автоклавируйте все инструменты перед использованием.
- Выполняйте операцию с использованием техники асептического наконечника. Повторно стерилизуйте инструменты между животными с помощью стерилизатора для бусин. Наденьте стерильные перчатки, лабораторный халат и маску для лица.
3. Подготовка животных
- Обезболивайте мышей кетамином/ксилазином (87,5 мг/кг и 12,5 мг/кг соответственно, в/) в соответствии с рекомендациями учреждения. Определите глубину анестетика, выполнив щипывание пальцев ног.
- Когда животное считается невосприимчивым, подготовьте место инъекции (например, левый бок) мышей Balb/c, выщипывая (пальцами) или сбривая (с помощью машинок для стрижки) шерсть.
- Переместите мышей из зоны подготовки к операции (например, из клетки для содержания) в операционную зону и нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. Обильно промокните подготовленное место разреза 5% повидон-йодным антисептиком.
- Введите бупивакаина гидрохлорид (0,1 мл раствора 2,5 мг/мл сук) в область, где будет сделан разрез, в качестве предоперационной анальгезии.
- Сделайте один разрез (от ~1,0 до 1,5 см) на левом боку животного с помощью стерильного скальпеля или ножниц аккуратно, чтобы не проникнуть в брюшину. Отделите дерму от брюшины стерильными ножницами. Промокните место разреза стерильной ватной марлей, чтобы удалить кровь.
- Держите мышь обеими руками, левой рукой держите голову, а правой рукой поддерживайте бок.
- Определите селезенку через брюшину и одним пальцем правой руки пропальпируйте мышь снизу; теперь почка должна быть видна через брюшину. Крепко держите животное, чтобы обеспечить напряжение через брюшину и почки.
- Второй человек должен ввести опухолевые клетки (подготовленные в разделе 1.2) через интактную брюшину в центр почки с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 28 калибра. Медленно подайте 0,1 мл (2 x 105) клеток. После введения клеток удерживайте иглу на месте в течение 5–10 секунд, чтобы уменьшить обратный ток клеток. Важно отметить необходимость крайней осторожности на этом этапе, так как человек, вводящий клетки, будет подносить иглу в непосредственной близости от пальцев человека, держащего мышь.
- Извлеките иглу и закройте разрез тонким слоем цианоакрилатного тканевого клея.
- Поместите животное обратно в чистую клетку со стерильным бумажным полотенцем. Дайте животным восстановиться на грелке. Не оставляйте животных без присмотра в период восстановления. Не возвращайте животных в стандартные условия содержания, пока они не станут прямыми и застенчивыми. Следуйте рекомендациям учреждения во всех процедурах с использованием лабораторных животных.