Анализ экспрессии белков на основе массивов белков с обратной фазой: процедура одновременной количественной оценки экспрессии нескольких белков из клеточного лизата

Аннотация

Источник: O'Mahony, F. C. et al. Использование белковых массивов обратной фазы (RPPA) для изучения вариаций экспрессии белка в отдельных почечных клетках рака. J. Vis. Exp. (2013)

Это видео демонстрирует методологию выполнения Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) для изучения паттернов экспрессии белков из клеточного лизата. В RPPA лизат, содержащий смесь белков, печатается на слайдах из нитроцеллюлозы, а интересующие белки анализируются с помощью флуоресцентно меченных антител.

Протокол

1. Печать RPPA

1. Белковые лизаты были обнаружены на стеклянных предметных стеклах с нитроцеллюлозным покрытием (Fastslides-Whatman) с помощью роботизированного споттера MicroGrid II. Использованные слайды содержали 2 прокладки, на которых были обнаружены образцы. На каждой площадке были обнаружены идентичные сэмплы, в данном случае 100 сэмплов. Другие доступные форматы включают слайды с 1, 8 и 16 блокнотами. Чем больше количество контактных площадок, тем меньше количество образцов, которые можно обнаружить на каждой из них.
2. Из каждого образца была сделана серия из пяти 2-кратных разведений, а затем каждое из них было обнаружено в трех экземплярах (в результате получилось в общей сложности 15 пятен на образец).

2. Обнаружение белка RPPA

1. Смочите предметные стекла в избытке блокирующего буфера LiCor (разбавленного в соотношении 50:50 в PBS). Инкубировать при RT в течение 1 часа на качающейся платформе.
2. Приготовьте 800 мкл первичных антител в блокирующем буфере LiCor (разбавленном 50:50 в PBS) в желаемых концентрациях и держите на льду.
3. Установите слайды в (i) зажим для стружки с одной рамкой или (ii) четырехсекционный держатель слайда 'FastFrame' так, чтобы между слайдом и инкубационной камерой образовалось плотное уплотнение.
4. Удалите остаточный буфер из лунок и добавьте 600 мкл первичного антитела в соответствующие лунки.
5. Поместите затвор и камеру в герметичный влажный бокс и выдерживайте на качающейся платформе в течение ночи при температуре 4 °C.
6. Составляйте 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 мл PBS).
7. Уберите предметные стекла из холодильной камеры и тщательно удалите первичные антитела из каждой лунки.
8. Добавьте 600 μL PBS-T и промойте горки на качающейся платформе в режиме RT в течение 5 минут (X3).
9. Получают флуоресцентно меченые вторичные антитела, разбавляя в блокирующем буфере Odyssey (разбавленном 50:50 в PBS) 0,01% SDS при разведении 1:2000 (1 μл/2 мл) в первую очередь.
10. Удалите буфер из лунок и добавьте 600 мкл флуоресцентно меченных вторичных антител в соответствующие лунки. Вторичные антитела инкубировать при комнатной температуре в течение 45 мин с легким встряхиванием; Важно защищать мембрану от света до тех пор, пока она не будет окончательно отсканирована.
11. Удалите вторичные антитела из лунки и кратковременно промойте (х3) в 600 мкл PBS-T при комнатной температуре. Снимите слайд с переноски, переложите в подходящую емкость и промойте излишки PBS-T в течение 15 минут, сохраняя мембрану в темноте.
12. Снять PBS-T и далее промыть мембрану PBS при комнатной температуре в течение 15 мин для удаления остатков Tween-20, снова держа мембрану в темноте.
13. Высушите Fastslide в духовке при температуре 50 °C в течение 10 минут, а затем отсканируйте на сканере Li-Cor Odyssey. Держите предметное стекло в темноте, пока оно не будет отсканировано.
14. Сканируйте предметное стекло с длиной волны 680 нм и/или 800 нм в зависимости от используемого вторичного антитела/антител. Для двухцветного детектирования всегда используйте вторичные антитела с высокой степенью перекрестной адсорбции, чтобы свести к минимуму перекрестную реактивность. Тщательный отбор первичных и вторичных антител необходим для двухцветного обнаружения. Первостепенное значение имеет выбор различных видов хозяев (например, кролика и мыши) для двух основных антител. Это позволяет различать вторичные антитела против кроликов и мышей, которые помечены красителем с легко различимыми спектрами излучения.
15. Файлы изображений сохраняются в виде файлов .tiff. На рисунке 1 изображено изображение отсканированных файлов.

Результаты

Рисунок 1. Блок-схема процесса сканирования RPPA.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тритон Х-100	Тритон-Х	Т8787
Li-Cor Odyssey Буфер блокировки	Литий-Кор	927-40000
Роботизированный корректировщик MicroGrid II	Биоробототехника
Держатель слайдов FastFrame с четырьмя секциями	ватман	10486001
FAST Slide - 2-Pad	ватман	10485317
IRDye 680LT Козий антимышь IgG	Ликор	926-68020
IRDye 800CW Козий антикролик IgG	Ликор	926-32211 (английский)