Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление растворов
- Приготовьте 50-кратный исходный раствор эмбриональной среды E3, смешав 73,0 г NaCl, 3,15 г KCl, 9,15 г CaCl2 и 9,95 г MgSO4 в 5 л дистиллированной воды, и храните при температуре RT.
- Приготовьте 50-кратный исходный раствор эмбриональной среды E3, смешав 73,0 г NaCl, 3,15 г KCl, 9,15 г CaCl2 и 9,95 г MgSO4 в 5 л дистиллированной воды, и храните при температуре RT.
- Для культивирования эмбрионов рыбок данио разбавьте 50-кратный исходный раствор питательной среды для эмбрионов E3 до 1x рабочего раствора с дистиллированной водой, затем добавьте 200 μл 0,05% метиленового синего на каждый 1 л 1x E3, чтобы он действовал как фунгицид, и храните при RT.
- Приготовьте раствор, блокирующий пигментацию, из эмбриональной среды Е3 с 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ), смешав 40 мл 50-кратного запаса Е3 с 0,06 мг ПТУ. Затем доведите объем в общей сложности до 2 л с помощью дистиллированной воды.
- Перемешайте E3/PTU O/N при RT, чтобы порошок PTU превратился в раствор. Затем сохраните E3/PTU в RT.
заметка: Срок годности E3/PTU составляет примерно одну неделю, и старые решения будут менее эффективны для блокирования развития пигментации у личинок рыбок данио.
- Приготовьте обезболивающий раствор из 0,2% трикаина (MS-222), добавив 1 г трикаина в 500 мл дистиллированной воды, и отрегулируйте pH до 7,2 с помощью 1 М Tris, pH 9,5.
2. Подготовка инструментов
- Подготовьте инструмент для манипулятора эмбрионов, используемый для позиционирования эмбрионов для микроинъекций, прикрепив наконечник гелевой загрузочной иглы на конце прямой иглы для препарирования 5 дюймов, и закрепите его лентой или суперклеем.
- Подготовьте иглы для микроинъекций с помощью съемника игл, сначала поместив в инструмент отполированное огнем боросиликатное стекло толщиной 10 см с нитью накала, и закрепите боросиликатное стекло, затянув ручки.
- Потяните за боросиликатное стекло, чтобы сделать тонко конические иглы. Используйте следующие настройки: нагрев 540, тяга 245, скорость 200 и время 125.
- Поместите иглы внутрь чашки Петри, подвесив их на полоске пластилина, чтобы защитить кончики игл, и держите чашку накрытой, чтобы предотвратить накопление пыли.
- Чтобы закончить подготовку иглы к микроинъекциям, с помощью лезвия бритвы или тонкого края щипцов разрежьте вытянутый конец иглы, чтобы получился острый угловой кончик инъекции диаметром примерно 0,05–0,1 мм.
- Чтобы сделать лоток для микроинъекций, приготовьте 1,5% раствор агарозы/E3 в колбе Эрленмейера объемом 100 мл и растворите агарозу, нагрев E3 до кипения в микроволновой печи, затем дайте остыть при RT в течение примерно 10 минут.
- Остывший раствор агарозы/Е3 вылейте в чашку Петри, чтобы получилась основа глубиной примерно 0,5 см. Когда он застынет, вылейте второй слой глубиной примерно 0,3 см и вставьте предварительно изготовленный зародыш в форму и дайте агарозе застыть при RT.
заметка: При вставке формы в верхний слой агара/Е3 поместите форму в агар под углом, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха.
- Когда весь лоток для микроинъекций схватится, поднимите предварительно изготовленный эмбрион, медленно и осторожно вылейте его с помощью совки, затем наполните чашку раствором E3 и храните при температуре 4 °C.
3. Микроинъекция раствора нефротоксина
- В день инъекции приготовьте нужный раствор нефротоксина вместе с соответствующим контролем автомобиля.
- Осторожно перемешайте или перемешайте, чтобы убедиться, что лекарство находится в растворе, проверяя боковые стороны трубки и верхнюю часть водяного столба><.
заметка: Растворы нефротоксина могут быть приготовлены таким образом, чтобы содержать следовые количества флуоресцентно конъюгированного декстрана для контроля эффективности микроинъекций, а также для оценки почечного клиренса в последующие временные точки.
- Загрузите обрезанную иглу для микроинъекций ~2–3 мкл нефротоксина, продев тонкий гелевый наконечник в заднюю часть иглы, и подвесьте иглу вертикально с помощью куска ленты, чтобы раствор мог заполнить обрезанный кончик иглы под действием силы тяжести.
- Как только кончик иглы заполнится, закрепите заряженную иглу в микроманипуляторе.
- Проверьте объем микровпрыска, поместив каплю минерального масла на предметное стекло микрометра, и введите в масло, чтобы оценить размер капли. Объем впрыска 500 пл имеет диаметр 0,1 мм.
- Достаньте чашку с эмбрионами из инкубатора и обезболите, добавив примерно 5 мл 0,2% трикаина в чашку для эмбрионов.
- Чтобы обеспечить полную анестезию, аккуратно прикоснитесь к эмбриону кончиком инструмента-манипулятора эмбрионов. Отсутствие движений свидетельствует о достаточной анестезии.
- После успешной анестезии перенесите эмбрионы в пресс-форму для литья под давлением с помощью трансферной пипетки.
- Переместите каждый эмбрион в отдельную лунку формы, поместив голову в самую глубокую область лунки таким образом, чтобы туловище лежало вдоль углубления, а хвост торчал из углубления.
- Вставьте заполненную иглу в микроманипулятор и расположите кончик иглы рядом с эмбрионом.
- Осторожно введите иглу в хвостовой сосуд, переместив джойстик вперед, и нажмите ножную педаль, чтобы подать микроинъекцию.
заметка: Об успешном впрыске можно судить, наблюдая за входом жидкости в циркуляцию. Кроме того, совместное введение нефротоксиканта с флуоресцентно конъюгированным декстрана позволяет исследователю убедиться в успешности инъекции после процедуры.
- Осторожно потяните за джойстик, чтобы извлечь иглу из эмбриона.
- После инъекции переложите эмбрионы в чистую чашку и промойте, чтобы удалить трикаин и заменить его свежим E3/PTU.
- Инкубируйте эмбрион до желаемого момента времени для оценки морфологии, которая может быть задокументирована с помощью фотографии в монтажной среде метилцеллюлозы, или процесса для экспериментального анализа по желанию.
заметка: Восстановление эмбрионов должно быть оценено для определения процента людей с отеком, который обычно указывает на повреждение почек.
