Подготовка плоского крепления почки: процедура вскрытия и подготовки плоского крепления для микроскопического анализа почки взрослой рыбки данио-рерио

Аннотация

Источник: McCampbell, K. K. et al. Анализ состава и функции нефрона в почках взрослой рыбки данио.J. Vis. Exp. (2014)

Это видео демонстрирует препарирование и подготовку плоского крепления почки взрослой рыбки данио. Подготовленное плоское крепление можно визуализировать под микроскопом для анализа образцов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Вскрытие и плоское препарирование почки взрослой рыбки данио из нефиксированного образца животного для визуализации флуоресцентного мечения декстрана проксимального канальца

1. Усыпьте взрослых рыбок данио, которым ввели декстран, поместив их в миску с 0,2% трикаином pH 7,0 на 4–5 мин.<бр/> заметка: Прежде чем продолжить, убедитесь, что рыба была усыплена, внимательно следя за тем, не перестали ли двигаться жабры и не перестало ли биться сердце.
2. С помощью пластиковой ложки достаньте рыбу из раствора Трикаина, сцедите раствор и положите животное на салфетку или бумажное полотенце.
3. С помощью острых ножниц для препарирования сделайте надрез за жаберным оперкулумом и удалите головку.
4. Сразу же вскройте тело рыбы ножницами для вскрытия, сделав длинный брюшной надрез от головы до основания хвостового плавника.
5. Удалите внутренние органы рыбы с помощью пары тонких щипцов.
6. Используйте сверхтонкие иглы для препарирования, чтобы вскрыть стенки тела, чтобы можно было визуализировать почечный орган, который прилегает к спинной стенке животного.
7. Используйте тонкие щипцы, чтобы отделить почку от дорсальной стенки.
8. Аккуратно поместите почку в стеклянный флакон объемом 5 мл, содержащий 1X PBS><, и промойте 3 раза 3–5 мл свежего 1X PBS в течение 5 минут каждый. заметка: Использование стеклянного флакона для работы с образцами почек взрослого человека облегчает визуализацию ткани и позволяет проводить промывки с большими объемами (относительно массы ткани) примерно 3–5 мл. В качестве альтернативы можно использовать 12-луночную чашку для клеточных культур. В то время как можно использовать пластиковую микроцентрифужную трубку, пробирки стандартного размера (1,5 мл) могут ограничивать промывку.
9. Удалите почку с помощью пипетки для переноса и поместите на чистое предметное стекло с 1–2 каплями 1X PBS.
10. Используйте тонкие щипцы, расплющив почку на предметном стекле, следя за тем, чтобы ни одна ткань не скрутилась или иным образом не перевернулась сама по себе.
    заметка: В качестве альтернативы можно использовать инструмент из вольфрамовой проволоки для выполнения небольших разрезов в соединительной ткани, чтобы облегчить уплощенное положение почки.
11. Положите небольшие кусочки пластилина на каждый угол стеклянного покровного стекла размером 18 x 18 мм и медленно установите покровное стекло на почку.
    заметка: Слегка наклоните покровное стекло во время размещения, чтобы свести к минимуму попадание пузырьков воздуха в раствор. Углубления для лепки из пластилина имеют диаметр около 2 мм (Рисунок 1А). В качестве альтернативы вместо пластилина можно заменить капли вакуумной смазки. Добавьте дополнительную каплю 1X PBS, чтобы заполнить пространство между покровным стеклом и предметным стеклом, если это необходимо.
12. Наблюдайте и/или визуализируйте почку, поместив предметное стекло в поле зрения стереомикроскопа или составного микроскопа с соответствующим фильтром.

Результаты

Рисунок 1. Приготовление и применение плоского крепления почек взрослых рыбок данио для визуализации поглощения конъюгированного декстрана в сегменте ПКТ почечных нефронов. (А)Светлопольное изображение препарата с плоским креплением для образца почки, в котором орган расположен плашмя на предметном стекле, с покровным стеклом, размещенным поверх ткани, которая покоится на четырех углублениях пластили...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1X PBS			Изготовлено путем разбавления 10 X PBS в дистиллированной воде.
Тонкие щипцы	Робоз	РС-1050	Узор для пинцета Dumont #55
Предметное стекло	Термофишер	No 4445	иней
Стеклянный покровный колпак	Термофишер	12-540А	18 x 18 мм
Пластилин для лепки	Хасбро	Пластил	Другие пластилины могут быть заменены и работать аналогично.
Держатель задвижки	Термофишер	12-587	Опционально: картонный лоток для хранения слайдов в плоском виде.
Стереомикроскоп	Компания Nikon	СМЗ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/ FITC; 83457-ТРИТК	Для детектирования DAPI, йодида пропидия, синего каскада декстран и щелочной фосфатазы использовался фильтр Hoechst/DAPI. Фильтр GFP/FITC использовался для обнаружения декстрана-FITC, желтого люцифера и антиGFP. Фильтр TRITC использовался для обнаружения декстран-фторрубина, PI и DBA.
Составной микроскоп	Компания Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Техасский красный	Для детектирования DAPI, йодида пропидия, синего каскада декстран и щелочной фосфатазы использовался фильтр Hoechst/DAPI. Фильтр GFP/FITC использовался для обнаружения декстрана-FITC, желтого люцифера и антиGFP. Фильтр Texas Red использовался для обнаружения декстран-фторрубина, PI и DBA.