Депигментация и преокрашивание почек данио-рерио: техника подготовки почки взрослой рыбки данио к окрашиванию

Аннотация

Источник: McCampbell, K. K. et al. Анализ состава и функции нефрона в почках взрослой рыбки данио. J. Vis. Exp. (2014)

В этом видео мы демонстрируем депигментацию почек взрослой рыбки данио-рерио и ее последующую подготовку к процедурам окрашивания. После окрашивания почка взрослой рыбки данио может быть использована для изучения регенерации почек, фенотипической характеристики моделей почечных заболеваний и функциональности нефрона.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Фиксация, диссекция, пермеабилизация и удаление пигментации почки взрослой рыбки данио-рерио

1. Приготовьте свежий фиксирующий раствор из 4% параформальдегида (PFA)/1X PBS/0,1% DMSO или разморозьте замороженную аликвоту из 4% PFA/1X PBS и добавьте 0,1% DMSO.
   ВНИМАНИЕ: ПФА токсичен, и с растворами ПФА следует работать в химическом капюшоне, надев подходящие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и лабораторный халат. Кроме того, с порошком PFA следует обращаться осторожно при приготовлении исходного раствора.
2. Заполните лоток для вскрытия достаточным количеством фиксирующего раствора, чтобы погрузить животное целиком.
3. Усыпьте и установите выбранную рыбку данио в фиксирующий раствор.
   заметка: Выбранная рыба может быть необработанным образцом почки данио-рерио или почкой, выделенной от данио-рерио, которая ранее получала внутрибрюшинную инъекцию декстрана.
4. Зафиксируйте O/N образца (12–16 часов) при 4 ^°C.
5. На следующий день с помощью тонких щипцов осторожно отделите почку от дорсальной стенки тела и поместите орган в стеклянный флакон с помощью переводной пипетки><. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать 12-луночную или 24-луночную чашку для культивирования. В то время как можно использовать пластиковую микроцентрифужную пробирку, пробирки стандартного размера (1,5 мл) могут ограничивать промывку.
6. Рассеченную почку промыть 3 раза 3–5 мл 1X PBS с 0,05% Tween в течение 5 мин каждая.
7. Удалите 1X PBS с 0,05 % Tween и промойте почку 3 мл 5% раствора сахарозы (в 1X PBS) в течение 30 минут.
8. Замените 3 мл 30% раствора сахарозы (в 1X PBS) и храните O/N (12–16 часов) при 4 ^oC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы сахарозы проникают через клеточные мембраны, впоследствии позволяя специфично мечить реагенты по мере их проникновения в ткани.
9. На следующий день удалите 30% раствор сахарозы и промойте почку 2 раза 5 мл 1X PBS с 0,05% Tween в течение 5 минут каждая.
10. Замените 1X PBS на 0,05% Tween на 3–5 мл отбеливающего раствора, чтобы удалить пигментацию меланоцитов, присутствующую на почечном органе.
11. Поместите стеклянный флакон на вращатель и внимательно наблюдайте, как исчезает пигментация.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Депигментация обычно занимает около 20 минут после лечения сахарозой, но иногда может занимать до 60 минут. Если отбеливающий раствор оставить на почке слишком долго, может произойти распад органа; Рекомендуется контролировать образец каждые 10–15 минут для проверки целостности тканей.
12. Когда пигментация будет удалена из почки, дважды промойте 3–5 мл 1X PBS с 0,05% Tween.
13. Замените 1X PBS на 0,05% Tween на 3–5 мл 4% раствора PFA на 1 час в режиме ЛТ.
14. Удалите 4% раствор PFA и промойте почку 3 раза 3–5 мл 1X PBS с 0,05% Tween в течение 5 мин><. ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения фиксации почка также может быть установлена на предметное стекло и оценена на предмет поглощения декстрана без пигментации меланоцитов.
15. Удалите 1X PBS с 0,05% Tween и замените 3–5 мл блокирующего раствора, затем инкубируйте почку в RT в блоке в течение 2 часов.
16. Когда блокировка будет завершена, перейдите непосредственно к выбранному протоколу окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Почка теперь может быть обработана с помощью одной или нескольких других процедур для проведения исследований маркировки различными реагентами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1X PBS			Изготовлен путем разбавления 10X PBS в дистиллированной воде
1X PBST			0,1% моющее средство Tween-20 в 1X PBS
1X PBS с 0,05 % анимацией			0,05% моющего средства Tween-20 в 1X PBS
Подросток 20	Американская биоаналитическая	AB02038
4% PFA/1X PBS			Растворите 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat #19210) в 1X PBS, доведите до кипения на горячей плите в вытяжном шкафу. Охладите и заморозьте аликвоты для хранения в морозильной камере при температуре -20°C. Разморозьте непосредственно перед использованием и не замораживайте запасы повторно
Отбеливающий раствор			Формула смеси отбеливателя (для 20 мл раствора): 1,6 мл 10% раствора гидроксида калия 0,6 мл 30% раствора перекиси водорода 100 мкл 20% подростка Залейте до 20 мл дистиллированной водой
едкое кали	сигма	221473
перекись водорода	сигма	Н1009
Решение для блокировки			Блокирующий раствор (для раствора 10 мл): 8 мл 1X PBS с 0,05% Tween 2 мл сыворотки плода теленка 150 мкл ДМСО