Экспансионная патология: метод оптической визуализации клинических образцов тканей с высоким разрешением

Аннотация

Источник: Klimas, A. et al. Наноскопическая визуализация срезов тканей человека с помощью физического и изотропного расширения.J. Vis. Exp.(2019)

В этом видео мы описываем метод, называемый патологией расширения, вариант экспансионной микроскопии, при котором клинические образцы тканей химически расширяются с использованием полимерной сетки для микроскопического исследования наноразмерных структур.

Протокол

1. Полимеризация образцов in situ

1. Инкубируйте образец в растворе для анкерного крепления.
   1. Приготовьте анкерный раствор (обычно 250 мкл достаточно для покрытия участка ткани) путем разбавления стокового раствора AcX в 1x PBS до концентрации 0,03 мг/мл для образцов, зафиксированных неальдегидными фиксаторами, или 0,1 мг/мл для образцов, зафиксированных с альдегидными фиксаторами, которые имеют меньшее количество свободных аминов, доступных для реакции с AcX.
   2. Поместите предметное стекло в чашку Петри диаметром 100 мм и нанесите пипеткой анкерный раствор на ткань. Инкубировать не менее 3 ч при RT или в течение ночи при 4 °C.
2. Инкубируйте образцы в желирующем растворе.
   1. Приготовьте не менее чем в 100 раз избыточный объем желирующего раствора. На 200 мкл соединить в следующем порядке: 188 мкл раствора мономера, 4 мкл 0,5% стокового раствора 4HT (разведение 1:50, конечная концентрация: 0,01%), 4 мкл 10% стокового раствора TEMED (разведение 1:50, конечная концентрация 0,2%) и 4 мкл 10% стокового раствора APS (разведение 1:50, конечная концентрация 0,2%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желирующий раствор следует вносить непосредственно перед использованием. Раствор следует хранить при температуре 4 °C, а раствор APS следует добавлять в последнюю очередь, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.
   2. Удалите излишки раствора с участка ткани и поместите предметное стекло в чашку Петри диаметром 100 мм. Добавьте свежий холодный желирующий раствор в образец и инкубируйте смесь на ткани в течение 30 минут при 4 °C, чтобы обеспечить диффузию раствора в ткани.
3. Соорудите камеру на предметном стекле вокруг образца (рисунок 1A), не нарушая желирующий раствор.
   1. Сделайте распорки для камеры желирования, тонко нарезав кусочки покровного стекла с помощью алмазного ножа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения визуализации после расширения, спейсеры должны быть близки по толщине к образцу ткани, чтобы уменьшить количество пустого геля над тканью. Стекло номер 1,5 может быть использовано для стандартных клинических образцов (5−10 мкм). Кусочки покровного стекла можно складывать друг на друга для получения более толстых образцов.
   2. Закрепите спейсеры с обеих сторон ткани с помощью капель воды (~10 μл).
   3. Осторожно накройте предметное стекло крышкой, стараясь не задерживать пузырьки воздуха над салфеткой (рисунок 1B).
4. Инкубировать образец при 37 °C во влажной среде (например, в закрытой чашке Петри с влажной салфеткой) в течение 2 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Шиберная камера может храниться внутри герметичной чашки Петри при температуре 4 °C.

2. Разложение образца

1. Снимите крышку желирующей камеры, осторожно проведя лезвием бритвы под покровным стеклом и медленно приподняв покровное стекло с поверхности геля. Обрежьте пустой гель вокруг салфетки, чтобы свести к минимуму объем. Разрежьте гель ассиметрично, чтобы отследить ориентацию геля после гомогенизации, так как образец станет прозрачным.
   1. Перед применением разведите ProK в соотношении 1:200 в буфере для разложения (конечная концентрация 4 Ед/мл). Приготовьте достаточное количество раствора, чтобы полностью погрузить гель; Для одной лунки четырехлуночного пластикового планшета для культивирования клеток требуется не менее 3 мл на лунку.
   2. Образец инкубируют в закрытом контейнере, содержащем буфер для разложения, в течение 3 ч при 60 °C. Если образец не отделяется от предметного стекла во время разложения, аккуратно удалите образец бритвенным лезвием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть полностью погружен в буфер для сбраживания во избежание высыхания образца и помещен в закрытый контейнер (небольшой предметный ящик, пластиковый колодец, чашка Петри и т. д.), который может быть запечатан пленкой.

3. Расширение образца и визуализация

1. Используйте мягкую кисть, чтобы перенести образец в 1x PBS в контейнер, совместимый с желаемой системой визуализации и достаточно большой, чтобы вместить полностью расширенный гель. Убедитесь, что ткань расположена образцом вниз при визуализации на инвертированной системе или вверх при визуализации на вертикальной системе, чтобы свести к минимуму расстояние от объектива визуализации до образца. При необходимости переверните гель мягкой кистью.
   заметка: Боковая подсветка от светодиода может быть использована для того, чтобы сделать их видимыми в жидкости. Стандартный 6-луночный планшет может вместить образцы, которые имеют предварительно расширенный диаметр менее 0,6 см. Для визуализации в инвертированной системе следует использовать луночную пластину со стеклянным дном.
2. Промойте образцы в 1x PBS при RT в течение 10 минут. При желании повторно окрашивайте образец DAPI с температурой 300 нМ, поскольку в процессе разложения пятно DAPI смывается. Удалите PBS и пятно с помощью 300 нМ DAPI, разведенного в 1x PBS в течение 20 минут при RT, затем простирайте 10 минут 1x PBS при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть покрыты 1x PBS и храниться при температуре 4 °C, прежде чем переходить к следующему этапу.
3. Для расширения образцов замените PBS и промойте избыточным объемом ддН₂О (не менее чем в 10 раз больше конечного объема геля) 3−5 раз по 10 мин каждый, при RT.
   заметка: После^3-й или^4-й промывки расширение экземпляра должно начать выходить на плато. Для хранения, чтобы предотвратить рост бактерий, ddH₂O может быть дополнен 0,002%-0,01% азида натрия (NaN₃). В этом случае итоговый коэффициент расширения обратимо уменьшается на 10%.
4. Выполняйте флуоресцентную визуализацию с помощью обычного широкоугольного микроскопа, конфокального микроскопа или другой системы визуализации по вашему выбору.
   заметка: Чтобы гели не дрейфовали, из колодца можно удалить лишнюю жидкость. Гели также могут быть иммобилизованы 1,5−2% малоплавкой агарозы. Приготовьте 1,5−2%(w/v) малоплавкой агарозы в воде в емкости, в 2−4 раза превышающей объем раствора. Подогрейте раствор на водяной бане при температуре 40 °C или в микроволновой печи в течение 10−20 с, чтобы раствор расплавился. Пипеткой расплавите агарозу по краям геля. Дав агарозе затвердеть при RT или 4 °C, добавьте воду в образец, чтобы предотвратить обезвоживание.

Результаты

Рисунок 1: Камера гелеобразования для патологических образцов. (A) Два спейсера, такие как два куска защитного стекла #1.5, вырезанного алмазным ножом, размещаются по обе стороны ткани после инкубации образца в желирующем растворе при 4 °C. Спейсеры должны быть толще, чем срезы ткани, чтобы предотвратить сдавливание образца. (B) Крышка, такая как кус...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6-луночная стеклянная нижняя пластина (#1.5 покровное стекло)	Селлвис	П06-1,5Н-Н
ацетон	Fischer Scientifc	А18-500
Акриламид	Сигма Олдрич	А8887
Акрилоил-Х SE, (AcX)	Инвитроген	А20770
агароза	Fischer Scientifc	БП160-100
Персульфат аммония (АФС)	Сигма Олдрич	А3678	Инициатор
DAPI (1 мг/мл)	Термо Сайентиал	No 62248	Ядерное пятно
Алмазный нож No88 СМ	Общие инструменты	31116 (Английский
этанол	Фармко	111000200
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 0,5 М	ВВР	BDH7830-1
Образец почки FFPE	USBiomax	ХуFPT072
щипцы
Микрокрышка Стекло #1 (24 мм x 60 мм)	ВВР	48393 106
Микрокрышка Стекло #1.5 (24 мм x 60 мм)	ВВР	48393 251
N,N,N',N'-ТЕТРАМЕТИЛЭТИЛЕНДИАМИН (TEMED)	Сигма Олдрич	Т9281	акселератор
N,N'-метиленбисакриламид	Сигма Олдрич	М7279
Чашка для клеточных культур Nunclon на 6 лунок	Термо Фишер	140675
Nunc 15 мл конический	Термо Фишер	339651
Nunc 50 мл конический	Термо Фишер	339653
Орбитальный шейкер
малярная кисть
pH-метр
Фосфатно-солевой буфер (PBS) 10x Раствор	Fischer Scientifc	БП399-1
Пластиковая чашка Петри (100 мм)	Fischer Scientifc	FB0875713
Протеиназа К (класс молекулярной биологии)	Термо Сайентиал	ЭО0491
лезвие	Fischer Scientifc	12640
Пробирки для микроцентрифуг Safelock 1,5 мл	Термо Фишер	No 3457
Микроцентрифужные пробирки Safelock 2,0 мл	Термо Фишер	No 3459
Акрилат натрия	Сигма Олдрич	No 408220
Хлорид натрия	Сигма Олдрич	С6191
Цитрат натрия трехосновной дигидрат	Сигма Олдрич	К8532-1КГ
База Трис	Fischer Scientifc	БП152-1
Тритон Х-100	Сигма Олдрич	Т8787
ксилол	Сигма Олдрич	214736