$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Доступ латеральной пипетки к почке ниже колонки визуализации жидкости с помощью новой хирургической процедуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка системы поддержки визуализации и подготовки к операции показана на рисунке 1. Описанная методика выполнена на мышах C57BL/6 массой 20–25 г.
- Взвесьте мышь.
- Вызывают анестезию с помощью 4% изофлурана и поддерживают с помощью 1,5–2,5% изофлурана в смеси воздух/кислород. Подтвердите обезболивание мыши за счет отсутствия реакции на болевой раздражитель и снижения частоты дыхания.
- Смажьте глаза и расположите животное сбоку на опорной плите. Иммобилизуйте 4 конечности с помощью пластыря.
- Введите подкожно физиологический раствор в дозе 200 мкл и установите ректальный температурный зонд. Контролируйте температуру с помощью нагревательной лампы во время операции и грелки во время визуализации.
- Удалите все волосы с левой стороны мыши с помощью крема для депиляции.
- Найдите селезенку, которая видна под кожей, и найдите левую почку на дорсальной и каудальной стороне селезенки.
- Сделайте разрез 0,5 см на коже и меньший разрез на брюшине, ровно столько, чтобы почка могла легко протолкнуться.
- Выдавите почку с легким нажимом. Поместите вокруг почки форму стабилизатора почки, изготовленную из полисилоксана, и зафиксируйте цианоакрилатным клеем. Выровняйте почку с помощью спейсера таким образом, чтобы крайняя боковая поверхность почки выходила за пределы стабилизатора примерно на 1 мм.
- Закрепите пластину головки на форме стабилизатора с помощью клея и закрепите пластину на монтажных планках на опорной плите.
- Заполните лунку в полисилоксановой подложке, окружающую почку, 1% раствором агарозы, поместите сверху 10-миллиметровую защитную крышку и удерживайте до тех пор, пока агароза не станет твердой. Приклейте покровное стекло к пластине головки с помощью клея и создайте кольцо вокруг покровного стекла с помощью стоматологического цемента.
- Введите FITC-декстран (2 000 000 Да, 5% раствор, 100–150 мкл) ретроорбитально и быстро переместите мышь и фиксирующую пластину на предметный столик 2-фотонного микроскопа, поддерживая анестезию и обеспечивая достаточное удаление отходящих газов на предметном столике микроскопа.
2. Выбор подходящего клубочка и доступ пипетки к пространству Боумена
- Определения:
- Определите X как лево-вправо на экране и влево-вправо лицом к микроскопу
- Считывание SX (stage X) с контроллера сцены
- Определите PX как X пипетки на контроллере регулятора пипеток
- Определите Y как вверх-вниз на экране и вперед к микроскопу и обратно к 2-фотонной установке
- Определите Z как вверх к потолку, вниз к полу и измерено на сцене с помощью целевого положения Z.
- Определите S(O)Z как высоту сцены (на самом деле цели).
- Найдите поверхность почки, которую можно идентифицировать с помощью фильтров зеленого флуоресцентного белка (GFP) в окуляре. Благодаря введению ФИТК-Декстрана сосудистая сеть станет ярко-зеленой.
- Определите подходящий клубочек. После определения поверхности почки с помощью окуляра переключитесь в 2-фотонный режим (режим без сканирования) и исследуйте окно визуализации. Благоприятными характеристиками для микропунктуры являются: вертикальное расстояние ниже покровного стекла >30 мкм (для предотвращения столкновения пипетки и покровного стекла во время доступа) и боковое расстояние от боковой капсулы почки до клубочка <400 мкм (за пределами этого расстояния отклонение пипетки может увеличить вероятность промаха).
- Запишите боковое и вертикальное расстояние до точки прокола, точку на почечной капсуле непосредственно на стороне пипетки клубочка.
- Поднимите фокусную точку объектива в толщу воды, сохраняя координаты x и y ступени без изменений, всего около сантиметра.
- Введите наконечник пипетки в толщу воды и включите возбуждение 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Переместите пипетку в размерах x и y в точку максимальной флуоресценции наконечника, это будет центр объектива. Найти пипетку в глазу без этого точного предварительного расположения затруднительно. Поскольку квантовые точки флуоресцируют на одной и той же (в данном случае красной) длине волны независимо от длины волны возбуждения, возбуждение DAPI дает красную флуоресценцию, которая плотно сфокусирована на кончике, как показано на рисунке 2.
- Измените настройку возбуждения на красный флуоресцентный белок (RFP) и визуализируйте пипетку в окуляре, а затем точно центрируйте ее в глазном обзоре.
- Переключитесь на 2-фотонный режим и найдите пипетку под 2-фотонной, расположив ее точно по центру изображения. Это позиция регистрации.
- Сохраните изображение пипетки.
- Зарегистрируйте столик и координаты контроллера микропипетки.
заметка: Используйте дополнительный файл .html, который будет выполнять вычисления с использованием кода JavaScript (выгодно в системах, где не установлено программное обеспечение для работы с электронными таблицами) или электронную таблицу для расчета смещения между координатами столика и пипетки, а также для вычисления целевых координат для контроллера пипетки.
- Извлеките пипетку из столба воды по оси x, сохраняя z и y на прежних значениях.
- Переместите пипетку Z к целевому клубочку Z (т. е. переместите пипетку вниз в направлении Z ниже покровного стекла)
- Переместите пипетку Y в целевой клубок с координатой Y.
- Переместите 2-фотонный вид в реальном времени на целевой клубок Z, а затем на край почки и обратите внимание на SX.
- Рассчитайте ребро почки PX, используя смещение от регистрационного SX.
- Переместите предметный столик к пипетке (увеличьте SX) так, чтобы край почки находился далеко слева от экрана, но все еще был виден.
- Быстро продвигайте пипетку примерно на 100 мкм меньше края почки PX, рассчитанного выше.
- Найдите наконечник пипетки, медленно продвигая ее вперед. Увеличьте усиление красного цвета и следите за гистограммой красных пикселей (распределение пикселей смещается до того, как пипетка будет изображена в окне, из-за чрезвычайной яркости квантовых точек и нецелевой флуоресценции).
- Продвижение к краю почки под 2-фотонной визуализацией в реальном времени.
заметка: Перед вводом в почечную капсулу можно перенаправить пипетку в размерах Y и Z. Однако это может привести к поломке наконечника пипетки. Более консервативной мерой, если пипетка находится за пределами цели, является извлечение в измерении X до 2 см, перенаправление, а затем возврат в измерении X к краю почки. Когда пипетка находится в ткани, движение по любой оси, отличной от X, приводит к сгибанию пипетки, которое требует большого опыта для использования и часто приводит к поломке.
- Медленно направляйте пипетку по оси X к мишени glom PX, следя за SX. (Полезно время от времени возвращаться к клубочку, чтобы увидеть, не сместился ли он вообще после введения микропипетки).
- Когда вы находитесь в правильном месте, задокументируйте положение с помощью z-stack.
заметка: При наличии микропипетки можно вводить лекарственные препараты, белки или флуоресцентные индикаторы, отсасывать жидкость для последующего анализа или измерять давление или заряд относительно другого электрода.
3. Аспирация жидкости из пространства Боумена
- Настройте микронасос на впрыскивание 100 нл перфтордекалина в течение 2 минут, чтобы обеспечить проходимость пипетки и уменьшить путаницу из-за засорения пипетки во время входа. Повторите изображение, чтобы убедиться в положении пипетки.
- Подождите 4–6 минут для дополнительной фильтрации.
- Настройте микронасос на аспирацию до 300 нл со скоростью до 50 нл/мин.<бр/>
заметка: При такой скорости не наблюдается изменений в морфологии клубочков, что позволяет предположить, что она не изменяет скорость доставки жидкости в пространство во время аспирации. Поскольку при обычной микропунктуре нет масляного блока, восстановление этого объема, необходимого для масс-спектрометрии, может включать в себя некоторое количество введенного перфтордекалина и, возможно, трубчатую жидкость. Для таких анализов, как измерение ионочувствительных электродов, флуоресцентная спектроскопия, полимеразная цепная реакция и другие чувствительные конечные точки, могут использоваться меньшие объемы. Если масс-спектрометрия не является конечной точкой, можно использовать минеральное масло и стандартные методы микропунктуры для измерения объема аспирации перед хранением.
- Еще раз сфотографируйтесь.
- Извлеките пипетку и сохраните образец, добавив буфер TRIS и храня при температуре -80° перед анализом.
- Усыпьте мышь с помощью передозировки изофлурана или другого одобренного метода.
заметка: Фильтрат поступает в пространство путем фильтрации из клубочковых капилляров. Скорость однонефронной клубочковой фильтрации (SNGFR) у мышей составляет от 8 до 14 нл/мин. Однако силы Старлинга управляют SNGFR, и поэтому отрицательное гидростатическое давление в пространстве Боумена может увеличивать SNGFR. При стандартных методах микропунктуры для забора трубчатой жидкости используется трубчатая блокада маслом и нейтральным давлением, однако эти соединения мешают масс-спектрометрии (см. ниже); Таким образом, при этой методике ранний проксимальный канальец остается открытым. Кроме того, в момент аспирации пространство Боумена содержит неизвестный, но положительный объем фильтрата. Таким образом, скорость аспирации жидкости может превышать SNGFR.
заметка: В описанных здесь экспериментах цель состояла в том, чтобы получить больший по размеру, чем обычно, образец клубочкового фильтрата для масс-спектрометрического анализа нанопротеомными методами. Поскольку использование масс-спектрометрии исключает использование масляных блоков с минеральным маслом или воском (сложные смеси органических молекул, снижающих сигнал: шум в масс-спектрометрии), для наполнения микропипетки и шприца используется перфтордекалин. Известно, что перфтордекалин не блокирует канальцевый поток, но биологически инертен и не мешает масс-спектрометрии.
