Почечная органотипическая культура на курином КАМ: техника трансплантации мышиных почечных эксплантов на курином КАМ для индуцирования формирования почечной сосудистой архитектуры

Аннотация

Источник: Kaisto, S. et al. Оптимизация почечного органоида и органотипической культуры для васкуляризации, расширенного развития и улучшенной микроскопической визуализации. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео описывает метод изучения развития органов с использованием улучшенной установки ксенотрансплантации на хориоаллантоисной мембране (CAM) из эмбрионов птиц. Этот метод позволяет получить полностью васкуляризированные культивируемые эмбриональные органы и органоиды.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE

1. Изготовление минирезервуаров для культивирования эмбриональных почек и почечных органоидов мыши на куриных КАМ и проведение экспериментов по ксенотрансплантации

1. Используйте вставки для клеточных культур transwell, предназначенные для 6-луночных или 12-луночных планшетов.
   заметка: В зависимости от конкретного эксперимента могут использоваться большие или маленькие минирезервуары. Лучше всего использовать небольшие минирезервуары для ксенотрансплантации до восьми эмбриональных почек или когда на одном курином эмбрионе будет размещено несколько минирезервуаров (например, экспериментальные и контрольные образцы на одном и том же курином эмбрионе).
2. Срежьте боковые стороны вставок с помощью роторного мультитула с дисковой пилой или ручной пилы, чтобы создать пластиковое кольцо высотой 2 мм с прикрепленной к нему проницаемой мембраной.
3. Отполируйте края этих минирезервуаров скальпелем или острым ножом.
4. Стерилизуйте минирезервуары в 70% этаноле в течение не менее 1 часа.
5. Промойте минирезервуары в автоклавной воде двойной дистилляции и дайте им высохнуть в ламинарном колпаке.
6. Промойте минирезервуары в PBS и питательной среде (высокоглюкозный DMEM/10% FBS/1% пенициллин-стрептомицин).
7. Поместите резервуар в чашку Петри поверх капли (600 мкл/400 мкл) питательной среды мембраной вверх.
8. Рассекаемые ex vivo эмбриональные почки или почечные органоиды равномерно расположите на мембране с помощью пипетки или стеклянной капиллярной трубки. Избегайте оставлять много жидкости вокруг почек.
9. Дайте образцам прикрепиться к мембране в течение 2–24 ч в инкубаторе для клеточных культур при 37 °C и 5% CO₂,
   заметка: На маленьком вкладыше можно разместить до восьми эмбриональных почек мыши E11.5 или органоидов почек. Большая вставка рекомендуется, если для ксенотрансплантации будут использоваться более крупные кусочки эмбриональной ткани или клеточно-гидрогелевая смесь на большей площади CAM.
10. Взять 8-дневных ex ovo культивируемых эмбриональных цыплят, подготовленных по ранее опубликованным методикам, из инкубатора для клеточных культур
11. Перенесите минирезервуары в CAM так, чтобы графты были обращены к CAM, а мембрана их накладывала. Разместите минирезервуары на периферии CAM так, чтобы они не закрывали куриный эмбрион.
    заметка: При использовании небольших минирезервуаров, изготовленных из вставок Transwell для 12-луночных планшетов, на одном CAM можно разместить до трех минирезервуаров.
12. Добавьте 500 μL (6-луночная вставка) или 300 μL (12-луночная вставка) питательной среды в мини-резервуары.
13. Культивируйте образцы на курином CAM в течение максимум 9 дней. Ежедневно заменяйте питательную среду в минирезервуарах.
    заметка: Васкуляризация образцов может наблюдаться уже через 24–48 ч после трансплантации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточный инкубатор	Панасоник	13090543	Температура 37° C, влажность 90%, CO₂ 5%
Клеточный инкубатор	САНЬО	10070347	Инкубатор для курицы CAM-культура. Температура 37° C, влажность 90%, CO₂ 5%
Модифицированный Eagle's Medium от Dulbecco	сигма	Д777	Высокий уровень глюкозы
Этанол (70%)	ВВР
Фетальная бычья сыворотка	ГиКлон	SH3007003HI Термо Сайентиал
Щипцы DUMONT #5	Дюмон	#5SF
PBS -/-	Корнинг	20-031-СВ
PBS +/+	Биозапад	Х0520-500	Промывка мини резервуаров.
Пенициллин и стрептомицин	сигма	П4333
12-луночные вставки для клеточных культур Thincert с полистирольной мембраной с порами 0,4 мкм	Greiner Bio-One	665641
6-луночные вставки для клеточных культур Thincert с полистирольной мембраной 0,4 мкм	Greiner Bio-One	657610 (Английский

)