$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка стереотаксических единиц к операции
- Включите все наркозные аппараты, цифровые нониусные весы и цифровые инжекторы.
заметка: Все хирургические инструменты должны быть надлежащим образом очищены и стерилизованы перед операцией.
- Используйте анестезирующие аппараты с насадкой для индукционной камеры в шкафу биологической безопасности (Рисунок 1A).
- Убедитесь, что все трубки от наркозных аппаратов подключены к стереотаксическим рамкам (Рисунок 1B, вставка 1C) и зажимы на трубках открыты для всех используемых аппаратов. Закройте все зажимы на трубках, идущих на стереотаксические рамки, которые не будут использоваться для операции.
- Установите наркозные аппараты в соответствии с рекомендованной производителем скоростью потока носового конуса в зависимости от веса мыши (например, вес животного 25 г: скорость потока носового конуса 34 мл/мин).
заметка: Держатель для головы, входящий в эту стереотаксическую установку, рекомендуется только для взрослых мышей. Убедитесь, что рекомендации производителя, включенные в стереотаксическую установку, соблюдены.
- Убедитесь, что соответствующий анестетик (например, изофлуран), предварительно заполненный в шприце, прикреплен к наркозному аппарату (рисунок 1B).
заметка: Чрезмерное заполнение шприца может привести к тому, что во время операции мышам будет вводиться слишком много анестезии, что приведет к передозировке анестетика.
- Подготовьте сверла, повернув стопорный замок, вставив адаптер сверла и сверло диаметром 1 мм в каждое сверло, и заблокируйте сверло, вручную затянув блокировку сверла.
- Прикрепите сверла к стереотаксическим рамкам (рис. 1C).
2. Поместите мышей на стереотаксические рамки
- Обезболивайте мышей (например, изофлураном) с помощью вышеупомянутой индукционной камеры.
- Поддерживайте мышей на протяжении всей процедуры в глубоком обезболивающем плоскости. Процент анестезии, вводимой аппаратом, зависит от ряда факторов, в том числе: скорости потока, степени стимуляции и температуры тела. Часто наблюдайте за мышами на протяжении всей процедуры на предмет глубины анестезии, оценивая ритмичное дыхание (животное не задыхается); отсутствие пальпебрального рефлекса (трепетание век при стимуляции аппликатором с ватным наконечником); и отсутствие защемления пальцев ног (отведение конечности под вредным стимулом защемления пальцев ног).
заметка: Разные штаммы мышей будут по-разному реагировать на анестезию.
- После того, как мыши окажутся в подходящей, глубокой анестезиологической плоскости, переведите мышей в стереотаксическую установку. Используйте грелку, когда мышь находится на стереотаксическом аппарате, чтобы поддерживать температуру тела и соответствующую плоскость анестезии.
заметка: Для достижения низкого профиля мы используем активируемые воздухом грелки для рук, помещенные в перевернутую коробку для наконечника пипетки (коробка для подъема мыши на рисунке 1D).
- Откройте рот мыши и поместите зубы в желоб мундштука, расположенный на носовой части стереотаксической рамки (рисунок 2А). Наденьте носовой конус на нос/рот мыши (рисунок 2B).
- Поместите мышей так, чтобы их головы были на уровне ротовой перекладины. Аккуратно откройте рот тупым концом аппликатора с ватным наконечником и сдвиньте на место. Убедитесь, что носовой конус полностью прилегает к носу мыши, иначе анестезия не будет введена должным образом. Носовой конус не будет входить в зацепление с носом, если зубы не расположены в этой канавке (врезка рис. 2A).
- С помощью стерильной ватной палочки нанесите смазку для глаз на каждый глаз мыши. Применение глазной смазки смягчает высыхание роговицы и снижает вероятность повреждения роговицы и послеоперационных осложнений, связанных с травмой роговицы.
- Стабилизируйте череп мыши, прижав левый ушной стержень к медиальному кантусу левого уха, зафиксировав его на месте с помощью винта на стереотаксической раме. Затем сдвиньте правую ушную планку к медиальному кантусу правого уха и плотно закрутите стереотаксическую раму (Рисунок 2B).
заметка: Убедитесь, что голова мыши ровная и прямая, когда вы устанавливаете ушные планки. Если голова искривлена или наклонена, инъекция будет сделана в неправильное место в мозге. Ушные планки должны быть затянуты ТОЛЬКО до тех пор, пока череп не будет обездвижен после стимуляции с умеренным ручным зондированием.
3. Создание кальварного окна
- Подготовьте и очистите кожу головы 3 раза чередующимися проходами раствора бетадина и 70% этанола. Из-за непосредственной близости места операции к глазам используйте раствор бетадина поверх хирургического скраба.
- С помощью стерильного скальпеля сделайте разрез 3 мм через кожу вдоль центральной срединной поверхности черепа (по линии сагиттального шва). Кровотечение в месте разреза должно быть минимальным. Если это произошло, надавите на место кровотечения с помощью стерильного ватного аппликатора на >30 секунд.
- Определите и ориентируйте сверло перпендикулярно брегме (Рисунок 2C), обязательно сбросив цифровую шкалу нониуса на ноль.
- Переместите сверло на 2 мм латерально к сагиттальному шву и на 1 мм кпереди к коронковому шву (рис. 2C). Для воспроизводимости убедитесь, что расположение слева или справа от линии сагиттального шва остается одинаковым для всех животных.
- Поверните дрель на максимальную скорость. Убедитесь, что кожа отодвинута от сверла, чтобы избежать повреждения тканей вращающимся сверлом, и осторожно прикрепите сверло к черепу. Просверлите отверстие глубиной примерно 0,5 мм в кальварии, в результате чего получится кальварное окно. Будьте осторожны, не опускайте сверло слишком сильно, иначе оно просверлит мозг. Капание стерильного физиологического раствора в место сверла во время движения сверла может компенсировать любое тепло, выделяемое машиной, которое может привести к термическому повреждению окружающих тканей.
- Как только отверстие будет изготовлено, осторожно поднимите сверло и снимите его со стереотаксической рамки.
- Очистите сверла с помощью 70% этанола и отложите в сторону, если они используются снова. Если нет, удалите сверла и погрузите в 70% этанол.
