Анализ микроглиального фагоцитоза: анализ in vitro для создания модели микроглиального фагоцитоза для клеток нейробластомы с использованием макрофагов iPSC

Аннотация

Источник: Hall-Roberts, H. et al. Количественная визуализация in vitro для фагоцитоза мертвых клеток нейробластомы с помощью iPSC-макрофагов. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы проводим анализ микроглиального фагоцитоза для нейробластомы с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Анализ помогает оценить нарушение функции микроглии при нейродегенеративных заболеваниях.

Протокол

1. Мечение мертвых SH-SY5Y pH-чувствительным красным флуоресцентным красителем

1. Начните с фиксированных элементов SH-SY5Y, суспендированных в буферной среде HEPES, не содержащей фенола, красного. Подсчитайте количество клеток и удалите общее количество необходимых клеток в пробирку объемом 2 мл с низким содержанием связывающих белки. На каждый 1 миллион SH-SY5Y составьте общий объем в пробирке объемом 2 мл до 300–500 μL с помощью среды, не содержащей фенола красного цвета HEPES-буферизованной. Кратковременно прогрейте трубку на водяной бане при температуре 37 °C.
2. Восстановите чувствительный к pH красный флуоресцентный эфир STP (см. Таблицу материалов) и добавьте 12,5 мкг красителя на миллион SH-SY5Y в теплую 2 мл пробирку клеток. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 30 мин, защищенном от света. <бр/> заметка: Разновидность STP-эфира pH-чувствительного красителя реагирует с первичными аминами, в связи с чем меченый буфер не должен содержать свободные амины. Из-за потенциально ограниченной растворимости в водных буферах добавляйте растворенный в ДМСО краситель только для нагрева водного буфера, немедленно перемешивайте и исследуйте на наличие признаков осадка (темных частиц под световым микроскопом).
3. Добавьте 1 мл HBSS и центрифугируйте при 1200 x g в течение 7 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте 2 мл HBSS. Повторите центрифугирование.
4. Отбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в макрофагальных средах, свободных от фенола красного цвета (см. Таблицу материалов) до концентрации 200 000–1,2 миллиона клеток/мл, так что 50 μL составляет 10 000–60 000 клеток (т.е. в 0,5–3 раза больше SH-SY5Ys, чем iPSC-макрофагов).
   заметка: Феноловый красный в среде увеличивает фоновую флуоресценцию, и, следовательно, следует использовать феноловые красные среды, если необходимо выполнить визуализацию живых клеток. Не рекомендуется хранить окрашенный SH-SY5Ys более нескольких часов, так как это не было оценено. Держите испачканный SH-SY5Ys на льду и бейте от света.

2. Окрашивание iPSC-макрофагов

1. В шкафу биологической безопасности приготовьте раствор в макрофагальных средах темно-красного флуоресцентного, проникающего в клетки, сукцинимидилэфир-реактивного красителя (см. Таблицу материалов). Добавьте Hoechst 33342 (см. Таблицу материалов). Подогрейте рабочий раствор до 37 °C на водяной бане.
2. Осторожно отсасывайте среду iPSC-макрофагов путем пипетирования многоканальной пипеткой супернатанта клеток в стерильный резервуар. Добавьте 70 μл/лунку раствора красителя, приготовленного на шаге 2.1, в iPSC-макрофаги, используя многоканальную пипетку. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO₂.
3. Приготовьте экспериментальные обработки в феноловых красных макрофагальных средах. Включите 10 мкМ цитохалазин D в качестве лечения отрицательным контролем. После инкубации очень осторожно аспирируйте среду iPSC-макрофагов с помощью многоканальной пипетки и добавьте 100 μл/лунку буферизованного физиологического раствора Хэнка (HBSS) для промывки. Немедленно удалите HBSS с помощью щадящего пипетирования, затем добавьте 100 мкл среды ± соединения. Инкубировать в течение 10–1 ч при 37 °C и 5% CO₂,
   заметка: Цитохалазин D является мощным ингибитором актина и блокирует фагоцитоз. Для любых экспериментальных обработок, требующих более длительной инкубации, например, 24–72 ч, проводите экспериментальную обработку до этапа 2.1, используя 100 мкл/лунку обработки в полной макрофагальной среде. Следуйте шагам 2.1–2.3 в соответствии с протоколом, чтобы провести окрашивание клеток, а затем повторно провести обработку в макрофагальных средах, свободных от фенола, в отношении красных красных сред для оставшейся части анализа фагоцитоза.

3. Визуализационный фагоцитоз

1. Визуализация с высоким содержанием фиксированных элементов
   1. С помощью многоканальной пипетки добавьте 50 мкл меченого SH-SY5Ys в лунку, добавляя в каждую лунку на краю жидкости. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2 в течение 3-5 часов.
   2. После инкубации фагоцитоза осторожно аспирируйте надосадочную жидкость клеток пипетированием с помощью многоканальной пипетки и выбросьте. Вымойте один раз 100 μL PBS.
   3. Зафиксируйте планшет добавлением 100 мкл 2% параформальдегида и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
   4. Отсадите лунки и добавьте 100 μл PBS. Накрыть пластинчатым запайщиком и фольгой; хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока не потребуется. <бр/> заметка: Пробирная пластина может храниться в таком виде не менее недели без существенного ухудшения сигнала; Более длительное хранение не тестировалось.
   5. Включите микроскоп с высоким содержанием изображения (см. Таблицу материалов) и откройте программное обеспечение для захвата изображений. Загрузите пробирную пластину в микроскоп, нажав на значок «Загрузить» в верхней части экрана.
   6. Выберите вкладку Настройка. В выпадающих меню в верхнем левом поле: выберите подходящий тип пластины, выберите опцию автофокусировки Two Peak (Default), выберите объектив 40x Water, NA1.1, выберите режим Confocal и выберите биннинг 1.
   7. Промойте 40-кратный водяной объектив перед использованием в меню настроек.
   8. В поле «Выбор канала» с помощью значка «+» добавьте каналы DAPI, Alexa 647 и Alexa 568. Установите их для измерения в одной плоскости размером 1 мкм. Оптимизируйте настройки времени и мощности для повышения эффективности окрашивания пробирной пластины.
      заметка: В качестве ориентира установите DAPI с экспозицией 200 мс и 100% мощностью, Alexa 647 с экспозицией 1500 мс и 100% мощностью, а Alexa 568 с экспозицией 100 мс и мощностью 40%.
   9. Убедитесь, что каналы не измеряются одновременно, нажав на кнопку «Последовательность каналов», чтобы разделить каналы.
   10. В разделе Навигация | Определите Схему, выберите скважины измерения и выберите 9–12 полей для каждой скважины.
   11. Во время настройки нажмите на репрезентативное поле на карте пластин и проверьте каждый канал измерения по очереди, чтобы убедиться в наличии окрашивания и фокусировке изображений, отрегулировав смещение канала.
   12. Чтобы данные были загружены на сервер для удаленного анализа, нажмите на поле «Онлайн-задания» и соответствующее экранное имя, что позволит автоматически загружать данные на сервер после создания образа.
   13. Сохраните протокол анализа, нажав на кнопку «Сохранить».
   14. Нажмите на вкладку «Запустить эксперимент» вверху и назовите экспериментальную пластину, затем нажмите «Начать».

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коническая центрифужная пробирка 15 мл	сокол	352096	Для центрифугирования ячеек
2-20 μл, 20-200 μл, 100-1000 μл одноканальные микропипетки
4% параформальдегида в PBS	Альфа Аэсар	Дж61899	Для фиксации клеток
6-луночный планшет, обработанный культурой тканей
AggreWell-800 24-луночный планшет	Технологии стволовых клеток	No 34815 (Английский	Микролуночный 24-луночный планшет с низкой адгезией для формирования эмбриоидных телец
Автоматический счетчик ячеек
Настольная центрифуга
Настольная микроцентрифуга
CellCarrier-96 Ultra Микропланшеты, обработанные культурой тканей, черные, 96-луночные с крышкой	Перкин Элмер	6055302	96-луночный микропланшет, обработанный культурой тканей (ТС), с черными стенками лунки и оптически прозрачным дном, для анализа на фагоцитоз
Программное обеспечение CellProfiler			Программное обеспечение с открытым исходным кодом для анализа изображений фагоцитоза, полученных с помощью покадрового микроскопа живых клеток. Скачать бесплатно с сайта (http://cellprofiler.org/), для этого протокола используется версия 2.2.0.
Краситель CellTracker Deep Red	Термо Фишер	С34565	Глубокий красно-флуоресцентный, проникающий в клетки, сукцинимидилэфир-реактивный краситель для окрашивания цитоплазмы iPS-макрофагов. Растворите краситель CellTracker Deep Red в ДМСО до 2 мМ (1,4 мг/мл). Использовать при 1 мкМ, путем разбавления исходного материала ДМСО с макрофагальной средой.
Шкаф безопасности ламинарного потока воздуха класса 2
Баллон с газом CO2			Аксессуар для EVOS FL Auto
CO2-инкубатор, установленный на 37°C и 5 % CO2
Цитохалазин D	кайман	No 11330	Лечение отрицательным контролем для анализа на фагоцитоз. Восстановите в ДМСО до 10 мМ и храните аликвоты при -20°C, избегайте дальнейших циклов замораживания-оттаивания. Использовать в конечной концентрации 10 мкМ.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Компонент среды SH-SY5Y
Дмсо	сигма	Д8418	Растворитель для красителей CellTracker и pHrodo
Фетальная бычья сыворотка	сигма	Ф4135	Компонент среды SH-SY5Y
Geltrex LDEV-Free, сертифицированный hESC, матрица базальной мембраны со сниженным фактором роста	Инвитроген	A1413302	Сертифицированная hESC матрица базальной мембраны для культивирования iPSC
Добавка GlutaMAX	Gibco	35050-038 (Английский)	Компонент как заводских, так и макрофагальных сред
HBSS	Лонза	BE 10-547F	Сбалансированный солевой раствор Хэнка для этапов мойки
Человеческий рекомбинантный IL-3	Gibco	PHC0033	Компонент как заводских, так и макрофагальных сред
Решение для визуализации живых клеток	Термо Фишер	A14291DJ	Фенол безкрасный HEPES-буферизованный фильтрующий материал для маркировки мертвых SH-SY5Ys
Пробирки с низким связыванием белков 2 мл	Эппендорф	30108.132	Для окрашивания SH-SY5Ys
М-КСФ	Термо Фишер	PHC9501	Компонент как заводских, так и макрофагальных сред
mTeSR1 Средний	Технологии стволовых клеток	85850	Медиа iPSC
Многоканальный дозатор 20-200 мкл			Для работы с жидкостями на 96-луночной пластине
Реагент NucBlue Live ReadyProbes	Термо Фишер	Р37605	Препарат Hoechst 33342 в флаконе-капельнице для окрашивания ядер iPS-макрофагов, использовать 0,5 капли/мл в макрофагальных средах.
Opera Phenix Система скрининга с высоким содержанием	Перкин Элмер	HH14000000	Микроскоп с высоким содержанием изображения, используемый с программным обеспечением Harmony версии 4.9.
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-122	Компонент заводской, макрофаговой и SH-SY5Y среды
pHrodo iFL Красный STP-эфир	Термо Фишер	П36011	pH-чувствительный красный флуоресцентный краситель для мечения мертвых SH-SY5Ys. Восстановите порошок pHrodo iFL Red STP Ester в ДМСО до концентрации 5 мг/мл. Для каждого 1 миллиона SH-SY5Y добавьте 2,5 мкл (12,5 мкг) исходного эфира pHrodo iFL Red STP в предварительно нагретые клетки, взвешенные в растворе для визуализации живых клеток.
Серологический филлер для пипеток
Колба T175, обработанная культурой тканей			Сосуд для дифференцировки предшественников iPSC-макрофагов, известный как «фабрики»
Колба Т75			Сосуд для культуры SH-SY5Y
Прозрачная пластинчатая запайщики	Greiner Bio-One	676001	Для хранения и транспортировки пробирных пластин
Водяная баня, установленная на 37°C
X-VIVO 15 Medium с L-глутамином, гентамицином и феноловым красным	Лонза	БЭ04-418Ф	Компонент заводских и макрофагальных сред
X-VIVO 15 Medium с L-глутамином; без гентамицина и фенола красного	Лонза	04-744К	Феноловая красная макрофагальная среда, для использования при фагоцитозе без добавок и факторов роста

) Кабель контента