Выделение ядер из свежезамороженных тканей глиомы: метод получения интактных ядер из образцов опухоли глиомы

Аннотация

Источник: Нараянан, А. и др. Выделение ядер из свежезамороженных опухолей головного мозга для одноядерных РНК-секвенирования и ATAC-секвенирования. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео описывается протокол выделения одиночных ядер из свежезамороженной ткани глиомы. Выделенные одноядерные образцы могут быть использованы в качестве образцов для таких методов секвенирования, как секвенирование одноядерной РНК (snRNA) и анализ одноядерных ядер для секвенирования транспозазы-доступного хроматина (snATAC) для получения более глубокого понимания меж- и внутриопухолевой гетерогенности, наблюдаемой при глиоме центральных нервных тканей.

Протокол

1. Рассечение и диссоциация тканей

1. Переложите свежезамороженный образец ткани (10–60 мг) в предварительно охлажденную чашку Петри. Свежезамороженную ткань измельчить/нарезать бритвенным лезвием на мелкие кусочки на льду.
2. Добавьте 500 мкл охлажденного буфера для лизиса ядер в предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл. Поместите кусочки ткани в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую буфер для лизиса ядер, и перенесите в Douncer (Таблица материалов).
   заметка: Существует два пестика-гомогенизатора Dounce: «сыпучий» или «А» пестик для первоначального измельчения образца и «плотный» или «В» пест для полной гомогенизации образца.
3. Отбросьте кусочки ткани "рыхлым" пестиком примерно на 20 ударов, пока трение не уменьшится. Если присутствует мусор, проба может быть предварительно очищена путем фильтрации с помощью фильтра 100 мм.
4. Наносите «тугим» пестиком в течение 20 ударов для достижения полной гомогенизации тканей.
5. Перелейте гомогенат (около 500 мкл) в предварительно охлажденную пробирку объемом 2 мл. Добавьте 1 мл охлажденного буфера для лизиса. Аккуратно перемешайте и выдерживайте на льду в течение 5 минут. Аккуратно перемешайте с помощью наконечника пипетки с широким отверстием и повторите 1–2 раза во время инкубации.
6. Отфильтруйте весь гомогенат с помощью сетки фильтра 30 мкм, соберите в пробирку Falcon объемом 15 мл и перелейте обратно в новую предварительно охлажденную пробирку объемом 2 мл. Для всего гомогената обычно достаточно одного ситечка.
7. Проверьте под световым микроскопом, чтобы убедиться в удалении крупных обломков и неповрежденности ядерной мембраны. Ядра должны быть круглыми, а ядерная мембрана не должна быть искажена. Если присутствует мусор, ядра могут быть повторно отфильтрованы.
8. Центрифугируйте ядра при давлении 500 x g в течение 5 мин при 4 °C на настольной центрифуге. Удалите надосадочную жидкость, оставив ~50 мкл с гранулой, содержащей ядра. Аккуратно суспендируйте гранулу еще в 1 мл буфера для лизиса ядер и инкубируйте в течение 5 минут на льду.
9. Центрифугируйте ядра при 500 x g в течение 5 мин при 4°C. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу, добавьте 500 мл 1x гомогенизационного буфера (HB) (Таблица 1) и инкубируйте в течение 5 мин без повторного суспензирования. Затем ресуспендируйте ядра еще в 1,0 мл 1x HB.
10. Центрифугируйте ядра при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте ядра в 200 мкл 1x HB в новую пробирку объемом 2,0 мл.

    Таблица 1: Приготовление 1x гомогенизационного буфера нестабильного раствора (2 мл на образец)

    См. Кабель Кабель

    1x Гомогенизационный буферный нестабильный раствор (2 мл на образец)
    реагент	Финальная кон.	Объем на образец (μл)
    6x Буфер для гомогенизации нестабильный	1x	333.33
    1 м сахароза	320 мМ	640.00
    50 мМ ЭДТА	0,1 мМ	4.00
    10% NP40	0,1%	20.00
    Н2О		1006.27

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-Меркаптоэтанол	сигма	М6250
CaCl2	сигма	21115-100МЛ
ЭДТА (0,5 М)	Термо Сайентиал	Р1021
Falcon 15 мл Конические центрифужные пробирки	Научный центр Фишера	352096
Ситечки MACS SmartStrainers (100 мкм)	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-098-463
Mg(Ac)2	сигма	63052-100МЛ
НП-40	Абкам	АБ142227
Набор для выделения ядер: Nuclei EZ Prep	сигма	НУК101-1КТ
Безопасные замковые трубки 1,5 мл	Эппендорф	30120086
Безопасные замковые трубки 2,0 мл	Эппендорф	30120094
сахароза	сигма	С0389
Наконечники для пипеток с широким отверстием (1000 μл)	Темо Фишер Сайентиал	2079ГПК