$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Градиентное центрифугирование
- Добавьте 200 мкл 50% раствора йодиксанола (Таблица 1) для получения конечной концентрации 25% йодиксанола. Хорошо перемешайте 10 раз с помощью пипетки, установленной на 300 мл.
- Добавьте 300 мкл 29% раствора йодиксанола (табл. 2) в 25% смесь. Используйте тонкий наконечник P1000, чтобы избежать смешивания слоев.
- Добавьте 300 мкл 35% раствора йодиксанола (табл. 3) в 29% смесь. Используйте тонкий наконечник P1000, чтобы избежать смешивания слоев.
осторожность: Этот шаг требует постепенного удаления наконечника пипетки во время пипетирования, чтобы избежать чрезмерного смещения объема.
- Поместите образцы в центрифугу с качающимся ведром, вращайте в течение 20 минут при температуре 3 500 x g при 4°C с выключенным тормозом.
- Аккуратно извлеките образцы, не встряхивая, и наблюдайте под светом. Между вторым и третьим слоями должна быть видна четкая белая полоса 95% чистых ядер (Рисунок 1).
2. Выделение ядер
- Отсасывайте верхние слои до появления полосы белых ядер в межфазном диапазоне 29–35%.
- Соберите полосу ядер в объеме 200 мл, переложите в свежую пробирку и отфильтруйте с помощью фильтра 20 мкм (Таблица материалов).
заметка: Ядра не нуждаются в ресуспендии перед фильтрацией.
- Проверьте под световым микроскопом, чтобы убедиться в удалении крупных обломков и неповрежденности ядерной мембраны. Ядра должны быть круглыми, а ядерная мембрана не должна быть искажена.
- Подсчитайте ядра с помощью окрашивания трипановым синим на гемоцитометре и аликвотные ядра на snRNA-seq/snATAC-seq.
Таблица 1: Приготовление 6-кратной гомогенизационной буферной стабильной мастер-смеси
См.
| 6x Гомогенизационный буфер Стабильная мастер-смесь |
| реагент | Финальная кон. | Объем на 100 (мл) |
| 1 м CaCl₂ | 30 мМ | Версия 3.0 |
| 1 М мг (переменного тока)₂ | 18 мМ | 1.8 |
| 1 м Трис pH 7,8 | 60 мМ | 6,0 |
| H₂O | | 89,2 |
| Хранить при комнатной температуре, избегать прямого воздействия света |
Таблица 2: Приготовление 1 М сахарозы
| 1 м сахароза |
| 34,23 г сахарозы |
| Растворить в 78,5 мл воды |
| Наполните водой до 100 мл |
Таблица 3: Приготовление 6-кратного гомогенизационного буфера нестабильного раствора (650 мкл на образец)
| 6x Нестабильный раствор буфера гомогенизации (650 мл на образец) |
| реагент | Финальная кон. | Объем на образец (μл) |
| 6x Гомогенизационный буфер стабильный | В 6 раз | Тел.: 648.84 |
| 100 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) | 0,1 мМ | 1.08 |
| 14,3 М β-меркаптоэтанол | 1 мМ | 0,08 |
