Фиксация и окрашивание срезов криоконсервированной ткани: процедура обработки замороженных срезов ткани мозга для лазерной микродиссекции

Аннотация

Источник: Comba, A. et al. Лазерный захват микродиссекции субрегионов глиомы для пространственной и молекулярной характеристики внутриопухолевой гетерогенности, онкопотоков и инвазии.J. Vis. Exp.(2020)

В этом видео представлен метод фиксации и окрашивания для обработки замороженной ткани опухоли мозга мыши. Обработанная ткань помогает дифференцировать и получить определенную популяцию клеток при последующей микродиссекции лазерного захвата.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Фиксация и окрашивание криоконсервированных участков мозговой ткани

1. Чтобы сохранить целостность РНК, очистите все используемые инструменты с помощью чистящего раствора РНКазы. Продолжайте выполнять протокол фиксации и окрашивания внутри вытяжного шкафа.
2. Готовьте описанные фиксирующие растворы в чистых пробирках объемом 50 мл без РНКазы. Все растворы следует использовать в воде, не содержащей РНКазы, в день окрашивания.
3. В тот же день будет проведена лазерная микродиссекция, приготовление 100%, 95%, 70% и 50% растворов этанола. Храните растворы в плотно закрытых пробирках при комнатной температуре.
4. Приготовьте 4% Cresyl violet и 0,5% эозин Y в 75% растворе этанола. Энергично ввергните раствор в течение 1 минуты и отфильтруйте его через нейлоновый фильтр толщиной 0,45 мкм, чтобы удалить следы нерастворенного порошка.
5. Поместите предметные стекла в емкость с 95% этанолом на 30 с. Перенесите предметные стекла в пробирку, содержащую 75% этанола, оставьте предметные стекла там на 30 с.
6. Переложите предметные стекла на 50% этанол и оставьте их там на 25 секунд. На этом этапе ОКТ будет растворен. Перенесите предметное стекло в 4% раствор Cresyl violet на 20 с, а затем переложите на 0,5% раствор эозина Y на 5 с.
7. Выньте предметное стекло из раствора красителя и промокните его насухо фильтровальной бумагой. Затем поместите предметные стекла в 50% этанол на 25 с. Перенесите предметные стекла на 75% этанол на 25 с. Перенесите предметные стекла на 95% этанол на 30 с. Переведите предметные стекла на 100% этанол на 60 с.
8. Промойте предметное стекло ксилолом. Переложите их в емкость с ксилолом и подождите 3 минуты.
9. Приготовьте монтажную среду (например, камедь Pinpoint) в воде, не содержащей РНКазы. Чтобы установить участки мозга мыши, разведите монтажную среду в воде, не содержащей РНКазы, в соотношении 1:10.
10. Высушите предметные стекла на поверхности, не содержащей РНКазы, при комнатной температуре в течение 10 секунд. Прежде чем ксилол высохнет, приступайте к монтажу предметных стекол с тканевыми срезами.
11. Аккуратно распылите монтажный раствор поверх ткани на предметном стекле стерильной тонкой кистью, не содержащей РНКазы. Подождите 10–20 с, а затем немедленно перенесите предметные стекла на микроскопическую платформу для микродиссекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение монтажной среды и воды, не содержащей РНКазы, используемой для монтажа, варьируется в зависимости от интересующей ткани. Соотношение монтажной среды/воды сохраняет морфологию ткани глиомы для лазерной микродиссекции, не влияя на целостность РНК.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Крезил фиолетовый ацетат	Сигма Олдрич	С5042
Эозин Ю	Сигма Олдрич	Е4009
Решение для обеззараживания РНКазы Zap	Научный центр Фишера	АМ9780
Стеклянное стекло с мембраной PEN (2 мкм)	Лиека	1150518
Решение Pinpoint	Исследование Zymo	Д3001-1
Салфетка-Плюс ОКТ Компаунд	Научный центр Фишера	Тел.: 23-730-571