$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Фиксация и окрашивание криоконсервированных участков мозговой ткани
- Чтобы сохранить целостность РНК, очистите все используемые инструменты с помощью чистящего раствора РНКазы. Продолжайте выполнять протокол фиксации и окрашивания внутри вытяжного шкафа.
- Готовьте описанные фиксирующие растворы в чистых пробирках объемом 50 мл без РНКазы. Все растворы следует использовать в воде, не содержащей РНКазы, в день окрашивания.
- В тот же день будет проведена лазерная микродиссекция, приготовление 100%, 95%, 70% и 50% растворов этанола. Храните растворы в плотно закрытых пробирках при комнатной температуре.
- Приготовьте 4% Cresyl violet и 0,5% эозин Y в 75% растворе этанола. Энергично ввергните раствор в течение 1 минуты и отфильтруйте его через нейлоновый фильтр толщиной 0,45 мкм, чтобы удалить следы нерастворенного порошка.
- Поместите предметные стекла в емкость с 95% этанолом на 30 с. Перенесите предметные стекла в пробирку, содержащую 75% этанола, оставьте предметные стекла там на 30 с.
- Переложите предметные стекла на 50% этанол и оставьте их там на 25 секунд. На этом этапе ОКТ будет растворен. Перенесите предметное стекло в 4% раствор Cresyl violet на 20 с, а затем переложите на 0,5% раствор эозина Y на 5 с.
- Выньте предметное стекло из раствора красителя и промокните его насухо фильтровальной бумагой. Затем поместите предметные стекла в 50% этанол на 25 с. Перенесите предметные стекла на 75% этанол на 25 с. Перенесите предметные стекла на 95% этанол на 30 с. Переведите предметные стекла на 100% этанол на 60 с.
- Промойте предметное стекло ксилолом. Переложите их в емкость с ксилолом и подождите 3 минуты.
- Приготовьте монтажную среду (например, камедь Pinpoint) в воде, не содержащей РНКазы. Чтобы установить участки мозга мыши, разведите монтажную среду в воде, не содержащей РНКазы, в соотношении 1:10.
- Высушите предметные стекла на поверхности, не содержащей РНКазы, при комнатной температуре в течение 10 секунд. Прежде чем ксилол высохнет, приступайте к монтажу предметных стекол с тканевыми срезами.
- Аккуратно распылите монтажный раствор поверх ткани на предметном стекле стерильной тонкой кистью, не содержащей РНКазы. Подождите 10–20 с, а затем немедленно перенесите предметные стекла на микроскопическую платформу для микродиссекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение монтажной среды и воды, не содержащей РНКазы, используемой для монтажа, варьируется в зависимости от интересующей ткани. Соотношение монтажной среды/воды сохраняет морфологию ткани глиомы для лазерной микродиссекции, не влияя на целостность РНК.