Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Препарат суспензии одиночных клеток из мозга
- Разбавьте градиентную среду в соотношении 9:1 с PBS в конической пробирке объемом 15 мл до получения конечного 100% раствора.
- Обезболивают мышей на пике ЭАЭ с помощью внутрибрюшинной инъекции 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг) и перфузируют внутрисердечно 20 мл стерильного ледяного PBS. Добиться этого можно путем медленного и постепенного введения PBS в левый желудочек сердца с помощью шприца объемом 20 мл и открытия правого предсердия.
- Осторожно разрежьте черепную коробку от носа до шеи, затем извлеките мозг из черепной коробки в 10 мл RPMI в конических пробирках объемом 50 мл. Хорошо перемешайте, чтобы удалить прилипшие эритроциты. Затем удалите среду с помощью аспирации и добавьте 10 мл RPMI.
- Поместите мозги и среду в посуду диаметром 100 мм. Мелко нарезать лезвием бритвы.
- Перелейте 6 мл из чашки в ледяной гомогенизатор из спеченного стекла объемом 7 мл с помощью чистой пипетки. Не оставляйте в пипетке большое количество ткани. Небольшая сумма неизбежна.
- Сначала измельчите мозг с помощью «рыхлого» поршня пестика, затем используйте «тугой» поршень до однородной суспензии и вылейте в предварительно охлажденную коническую трубку объемом 15 мл и держите на льду.
- После того, как все образцы будут гомогенизированы, оцените объем. Отрегулируйте громкость с помощью RPMI на 7 мл. Затем поместите 3 мл ледяной 100% матрицы базальной мембраны в охлажденную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 7 мл гомогената мозга, чтобы получить конечную среду с 30% градиентом плотности. Перемешиваем методом инверсии пару раз. Не делайте вихрей.
- Чтобы обеспечить четкую границу соприкосновения, осторожно и медленно добавьте 1 мл 70% градиентной среды подложки в RPMI с помощью пипетки объемом 3 мл.
- Центрифугируйте при 800 x g в течение всего 20 минут при 4 °C. Установите ускорение на 1 и замедление на 0. После центрифугирования аспирируйте почти всю верхнюю фазу, стараясь полностью удалить миелин в верхней части (Рисунок 1).
- Извлеките интерфейс в новую центрифужную пробирку на 15 градусов. Отрегулируйте громкость до 10 мл с помощью RPMI.
- Центрифугируйте при плотности 500 x g в течение 10 минут. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в ~200 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией (FSC).
