Методическая статья

Иммуноаффинная экстракция убиквитинилированных пептидов: метод селективного извлечения меченых убиквитином пептидов из очищенных пептидных фракций

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Bezstarosti, K. et al. Обнаружение сайтов убиквитинации белков с помощью пептидного обогащения и масс-спектрометрии. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео описывает метод извлечения и очистки убиквитинилированных пептидов, содержащих остатки диглициновых пептидов из сложной пептидной смеси. Представленный метод может помочь в выявлении оригинальных сайтов убиквитинации в белке.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Экстракция убиквитинилированных пептидов

  1. Используйте обратную фазовую хроматографию C18 с высоким pH с полимерным материалом неподвижной фазы (300 Å, 50 мкМ; см. Таблицу материалов), загруженным в пустой картридж с колонкой, для фракционирования триптических пептидов. Размер слоя неподвижной фазы должен быть отрегулирован в соответствии с количеством перевариваемого белка, подлежащего фракционированию. Приготовьте пустой картридж с колонкой объемом 6 мл (см. Таблицу материалов), заполненный 0,5 г материала неподвижной фазы для ~10 мг переваривания белка. Соотношение перевариваемого белка к неподвижной фазе должно составлять примерно 1:50 (по массе).
  2. Загрузите пептиды в подготовленную колонку и промойте колонку примерно 10 объемами колонки 0,1% TFA, а затем примерно 10 объемами колонки H2O.
  3. Разбавьте пептиды на три фракции 10 колонными объемами 10 мМ раствора формиата аммония (pH = 10) с 7%, 13,5% и 50% ацетонитрила (AcN) соответственно. Лиофилизируйте все дроби до полноты.
  4. Используйте антитела убиквитина (K-ε-GG), конъюгированные с шариками агарозы белка А для иммунообогащения пептидов diGly. Поскольку точное количество антител на партию гранул является служебной информацией и не разглашается производителем, рекомендуется использовать то же определение для партии гранул, что и производитель, чтобы избежать путаницы. Промойте одну партию этих бусин 2 раза с PBS и разделите суспензию для бусин на шесть равных частей. Подробную экспериментальную схему см. на рисунке 1.
  5. Растворите три пептидные фракции, собранные на этапе 1,3, в 1,4 мл буфера, состоящего из 50 мМ MOPS, 10 мМ фосфата натрия и 50 мМ NaCl (pH = 7,2), и уменьшите количество мусора.
  6. Добавьте надосадочную жидкость фракций в гранулы антител diGly и инкубируйте в течение 2 ч при 4 °C на ротаторной установке. Открутите шарики вниз и перенесите надосадочную жидкость в свежую партию гранул антител и снова инкубируйте в течение 2 ч при 4 °C.
  7. Храните надосадочную жидкость для последующего анализа глобального протеома (ГП).
  8. Переложите шарики из каждой фракции в наконечник для дозатора объемом 200 μл, оснащенный фильтрующей пробкой GF/F для удержания шариков. Поместите наконечник для пипетки с шариками в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, оснащенную адаптером для наконечника центрифуги. Промойте шарики 3 раза с 200 μL ледяного буфера IAP, а затем 3 раза с 200 μL ледяного Milli-Q H2O. Отжимайте колонку при 200 x g в течение 2 минут перед каждым этапом стирки, но будьте осторожны, чтобы колонка не высохла. Элюируйте пептиды с помощью 2 циклов по 50 мкл 0,15% TFA.
  9. Обессолите пептиды с помощью наконечника C18 stage (по сути, наконечника для пипетки объемом 200 мкл с двумя дисками C18) и высушите их до полной готовности с помощью вакуумного центрифугирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор эксперимента.(А) Обзор экспериментального подхода. Образцы подготавливали, трипсинизировали и фракционировали на три фракции с помощью обратной фазовой хроматографии с высоким элюированием pH. Одну партию коммерческих гранул антител к α-диГли разделяли на шесть равных фракций, а затем три пептидные фракции загружали на три фракции гранул. Пептиды diGly иммуноочищали, элюировали и собирали, после чего проточный поток пер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лизилэндопептидаза (LysC)Вако Пьюр Кемикалс129-02541 (Английский)
Печь NanoLCПроектирование MPI, MS Wil GmbH
N-лауроилсаркозин натриевая сольСигма-ОлдричЛ-5125
Orbitrap Fusion Lumos масс<бр /> спектрометрТермоФишер
PLRP-S (300 Å, 50 μm) полимерный<бр /> частицы с обратной фазойAgilent TechnologiesПЛ1412-2К01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif
(К-ε-ГГ) Комплект		Технологии клеточной сигнализацииNo 5562
Картридж Sep-Pak tC18 6 куб. см переменного токаводыWAT036790Извлеките материал tC18 из
картридж перед заправкой картриджа
с PLRP-S
Дезоксихолат натрияСигма-ОлдричNo 30970 (Английский
Трис-базаСигма-ОлдричТ6066
Трис-HClСигма-ОлдричТ5941
Лечение трипсином, ТПКТермоФишер20233
) г.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C18

Похожие статьи