Анализ синтеза ДНК: метод оценки синтеза ДНК в пролиферирующих клетках с использованием включения радиоактивного тритиативного тимидина

Аннотация

Источник: Williams, M. et al. Быстрое обнаружение фенотипов развития нервной системы в клетках-предшественниках нервной системы человека (NPC). J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы определяем пролиферативную способность нейронных клеток-предшественников, измеряя включение радиоактивного индикатора трититина в ДНК клеток. Эта методика может быть использована для изучения пролиферации клеток после лечения определенными препаратами и факторами роста.

Протокол

1. Обслуживание NPC

1. Поместите NPC с плотностью 1,5 миллиона клеток в лунку с гелевым покрытием, имитирующую ECM, содержащую 2 мл 100% расширяющей среды.
2. Инкубируйте NPC при температуре 37 °C во влажной среде с 5%_CO2.
3. Добавьте 5 мкМ ингибитора ROCK в среду для NPC с P3 или ниже, а также для размороженных NPC, чтобы предотвратить чрезмерную гибель клеток. Смените среду через 24 часа, чтобы удалить ингибитор ROCK.
4. Пассаж клеток каждые 4–9 дней, в зависимости от того, когда они сливаются. Клетки считаются сливающимися, когда они превращаются в плотно упакованный монослой, покрывающий все дно поверхности посуды.
5. Пластинчатые NPC с плотностью от 1 до 1,5 миллиона клеток на одну лунку 6-луночного планшета. Удаляйте использованный фильтрующий материал каждые 48 часов и заменяйте его 2 мл 100% расширяющего материала.

3. Анализ синтеза ДНК нейронных клеток-предшественников

1. Планшет 100 000 клеток/лунка в 24-луночном планшете и оцените в трех экземплярах/состоянии.
2. Добавьте радиоактивный, тритиированный [³H]-тимидин в питательную среду (1,5 μКи/мл) в каждую лунку после 46 ч в культуре. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 2 ч.<бр/> заметка: При использовании радиоактивных материалов пройдите обучение в своем учреждении, соблюдайте протоколы радиоактивной безопасности и утилизируйте радиоактивные материалы в специально отведенных для этого контейнерах.
3. Через 2 ч удалить и надлежащим образом утилизировать радиоактивные среды. Добавить 300 мкл предварительно подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА (0,5 мМ) в каждую лунку и инкубировать в течение 20 мин при 37 °C.
4. Включите комбайн с ячейками (см. раздел «Материалы») и насос и убедитесь, что давление насоса ниже 200 фунтов на квадратный дюйм. Поместите фильтровальную бумагу через пространство в комбайне для ячеек и оторвите правый угол, чтобы отметить ориентацию бумаги.
5. Поместите сборные трубки комбайна в пустой «чистый» лоток и нажмите на предварительную промывку, чтобы увлажнить фильтровальную бумагу. Поместите сборные трубки в лунки для отбора проб и запустите (запустите).
6. Когда комбайн завершит сбор образцов, поднимите зажим и переместите фильтровальную бумагу, чтобы повторить это для всех наборов образцов. Всегда предварительно стирайте в пустой, «чистой» тарелке.
7. Высушите фильтровальную бумагу под источником света и установите соответствующие флаконы в лоток. Разбейте бумажные чады во флаконы и добавьте в каждый флакон по 2 мл жидкого сцинтилляционного коктейля. Флаконы с крышками и этикетками.
8. Инкубируйте флаконы в жидком сцинтилляционном коктейле в течение не менее 1 ч перед считыванием количества в минуту (CPM) на сцинтилляционной машине.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Продвинутый средний DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010	Компонент 100% расширяющей среды
Нейробазальная среда	ThermoFischer Scientific	21103049
24-луночные планшеты	ThermoFischer Scientific	2021-05	Пластины из полистирола: используются для анализа синтеза ДНК NPC
Натуральный мышиный ламинин	Инвитроген	No 23017-015	Подложка для пластин для покрытия: используется для синтеза ДНК NPC, входа в S-фазу и анализа количества клеток
Пенициллин/стрептомицин	ThermoFischer Scientific	15140122	Антибиотик, компонент в расширяющей среде
2,5% трипсин (10X)	Gibco	15090-046	10X ферментативный раствор
0,5 м ЭДТА	ThermoFischer Scientific	АМ9261	Используется в растворе трипсина для лифтинга клеток для анализа синтеза ДНК
тритиированный [3H]-тимидин	ПеркинЭлмер	NET027E001	Радиоактивный тритий, тимидин
Fisherbrand 7 мл сцинтилляционных флаконов из полиэтилена высокой плотности	Фишербранд	Тел.: 03-337-1	Флаконы для жидкостного сцинтилляционного подсчета
ЭкоЛайт(+)	MP Biomedicals	188247501	Жидкий сцинтилляционный коктейль
LS 6500 Многоцелевой счетчик сцинтилляции жидкости	Бекман Коултер	8043-30-1194	Счетчик жидкостных сцинтилляций
Полуавтоматический комбайн Skatron	Molecular Devices и Skatron Instruments, Inc.	Тип 11019	Полуавтоматический клеточный комбайн
Фильтровальная бумага марки GF/C, ватман	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	1822-849	Фильтровальная бумага из стекловолокна

гг. (английский) гг.