Нейросферный анализ NPC: анализ in vitro для оценки миграционной реакции нервных клеток-предшественников из нейросферы

Аннотация

Источник: Williams, M. et al. Быстрое обнаружение фенотипов развития нервной системы в клетках-предшественниках нервной системы человека (NPC).J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует анализ миграции нейронных клеток-предшественников в нейросфере — анализ in vitro для изучения миграционного ответа нейронных клеток-предшественников из нейросферы — с помощью микроскопического анализа.

Протокол

1. Анализ миграции нейросферы NPC

1. Формирование нейросферы
   1. Добавьте 1 мл 100% расширяющего материала в чашку диаметром 35 мм без покрытия подложки. Инкубируйте чашки не менее 15 минут при температуре 37 °C перед посадкой NPC. Приготовьте 2–3 чашки, чтобы обеспечить достаточное количество нейросфер для анализа миграции клеток.
      заметка: Отсутствие подложки с покрытием гарантирует, что NPC остаются во взвешенном состоянии в среде, что имеет важное значение для формирования нейросферы. Покрытие посуды покрытием предотвратит образование нейросферы.
   2. Лифтинг, диссоциация и гранулирование клеток. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 2–5 мл предварительно подогретой 100% расширяющей среды. Поместите 1 миллион NPC в каждую 35-миллиметровую тарелку, приготовленную в разделе 1.1.1.
   3. Инкубируйте NPC при температуре 37 °C в течение 48–96 часов, чтобы позволить NPC агрегироваться и формировать нейросферы. Оценивайте размер сферы с помощью активной линейки на фазово-контрастном микроскопе. Подождите, пока большинство сфер достигнут приблизительного диаметра 100 мкм (± 20 мкм) (рис. 1). Более мелкие сферы полностью рассеиваются и распадаются во время миграционного анализа.
2. Подготовка планшетов для анализа миграции нейросферы
   1. Растворите аликвоты геля, имитирующего ECM, в 6 мл среды с 30% расширением. После приготовления раствора, имитирующего ЭКМ-гель/30% расширяющую среду, добавьте носители, факторы роста или лекарственные препараты в желаемых концентрациях.
      заметка: Концентрации носителей, лекарств и факторов роста должны быть увеличены с учетом добавления 200 мкл нейросфер в разделе 1.3.
   2. Нанесите 1 мл ЭХМ-имитирующего геля /раствора 30% расширяющей среды (± носителей, факторов роста или лекарств) в одну лунку 6-луночного планшета. Сделайте 2–3 лунки на одно опытное условие. В качестве альтернативы можно использовать посуду диаметром 35 мм. Инкубируйте планшеты не менее 30 минут при 37 °C^.
      заметка: НЕ отсасывайте раствор эмитаторного геля ECM/среды с 30% расширением для этого анализа. Нанесение сфер на аспирированный гель ECM-Mimic приведет к быстрой и избыточной миграции.
3. Гальванизация нейросфер
   1. Соберите нейросферы, образовавшиеся в разделе 1.1, и поместите их в коническую трубку. Вымойте посуду диаметром 35 мм 1 мл 1x PBS, чтобы убедиться, что все нейросферы собраны. Вращайте собранные нейросферы при 100 x g в течение 5 минут.
   2. Ресуспендируйте нейросферы в 1–3 мл предварительно нагретой среды с 30% расширением. Если собрана 1 чашка нейросфер, то 1 мл среды используется для ресуспендирования сфер. Если собраны 2 чашки, добавьте 2 мл среды для ресуспендирования сфер и т. д. Аккуратно пижите и используйте только P-1000, чтобы убедиться, что сферы не сломаны.
   3. Пластина 200 мкл ресуспендированных нейросфер в ЭКМ-имитирующий гель/раствор 30% расширения, выполненный в разделе 1.2. Скальные плиты во всех направлениях равномерно распределяют нейросферы. Инкубируйте планшеты в течение 48 часов при 37°C.
   4. Удалите ЭКМ-имитаторный гель/30% раствор расширяющей среды и закрепите клетки в 4% PFA, промойте и держите клетки в 1x PBS + 0,05% азида натрия.
4. Анализ нейросфер
   1. Получайте изображения целых нейросфер с использованием настроек фазового контраста при 10X. Убедитесь, что сферы не соприкасаются друг с другом. Измерьте среднюю миграцию с помощью программного обеспечения ImageJ.
   2. Обведите внешний контур нейросферы с помощью инструмента «Линия от руки». Доступ к свободной линии можно получить, щелкнув правой кнопкой мыши по значку «прямой» линии. Трассировка вручную с помощью мыши.
   3. Используйте функцию measure для вычисления площади трассировки. Убедитесь, что в окне «Задать измерения» на вкладке «Анализ» выбран параметр «Площадь». На рисунке 2 показан контур внешнего контура синего цвета.
   4. Проследите внутреннюю массу ячейки сферы и измерьте область. На рисунке 2 контур внутреннего контура выделен красным цветом. Количественно оцените среднюю миграцию путем вычитания внутренней клеточной массы из общей площади нейросферы.
   5. Измерьте нейросферы, которые демонстрируют плотно упакованную внутреннюю клеточную массу с клетками, мигрирующими в виде непрерывного ковра (рис. 2).
   6. Не включайте клетки за пределами ковра или оторванные от нейросферы для измерения. На рисунке 2 приведены примеры ячеек (обведены белым кружком), которые исключены из измерения внешнего ковра. Проанализируйте минимум 20 нейросфер для каждого состояния.

Результаты

Рисунок 1: Выбор нейросфер для анализа миграции. (A) Фазово-контрастное изображение репрезентативного поля нейросфер в течение 24 ч. Все сферы имеют размер менее 100 мкм и, таким образом, не собираются для анализа миграции. (B) Фазово-контрастное изображение репрезентативного поля нейросфер в течение 72 ч. Все сферы находятся в диапазоне от 100 мкм ± 20 мкм, что указывает на то, что они готовы к сбору д...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нейробазальная среда	ThermoFischer Scientific	21103049	Компонент как NIM, так и 100% расширяющей среды
Среда нейронной индукции PSC: Ссылка на протокол: https://goo.gl/ euub7a	ThermoFischer Scientific	A1647801	Это набор, который состоит из нейробазальной (NB) среды и 50-кратной нейроиндукционной добавки (NIS). NIS используется для изготовления 1X нейронной индукционной среды и 100% расширяющей среды
Продвинутый средний DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010	Компонент 100% расширяющей среды
Матригель с квалификацией hESC	Корнинг	354277	Квалифицированный гель для внеклеточного матриксмиматического геля, сертифицированный hESC (ECM-мимический гель)
6-луночные планшеты	Корнинг	КОР-3506	Полистирольные пластины, используемые для поддержания NPC и анализа миграции нейросферы
Человеческий базовый FGF-2	Пепротех	100-18В	Фактор роста
Пенициллин/стрептомицин	ThermoFischer Scientific	15140122	Антибиотик, компонент NIM, среда со 100% расширением и 30% расширением