Выделение астроцитов: метод получения чистого препарата кортикальных астроцитов мыши

Аннотация

Источник: Schildge, S. et al. Выделение и культивирование кортикальных астроцитов мыши. J. Vis. Exp. (2013)

В этом видео мы описываем метод получения чистого препарата астроцитов от новорожденных мышей.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Выделение и покрытие смешанных корковых клеток

Смешанное выделение корковых клеток для культур астроцитов может быть выполнено с использованием мышиных детенышей от P1 до P4. Для достижения правильной плотности астроцитов необходимо использовать 4 коры детенышей мыши на колбу для культуры тканей Т75. Таким образом, объемы в приведенном ниже протоколе рассчитываются для клеточного препарата с использованием 4 мышиных детенышей.

1. Перед началом процедуры диссекции предварительно подогрейте 30 мл питательных сред астроцитов (DMEM, высокий уровень глюкозы + 10% инактивированная при нагревании фетальная бычья сыворотка + 1% пенициллин/стрептомицин; см. таблицу) до 37 °C. Покройте одну колбу T75 20 мл поли-D-лизина (PDL) в концентрации 50 мкг/мл в воде для клеточных культур в течение 1 часа при 37 °C в инкубаторе CO₂.
2. Для процедуры вскрытия подготовьте все необходимые реактивы и материалы. Вам понадобятся хирургические ножницы, гладкие тонкие щипцы, щипцы с плоским кончиком, бумажные полотенца, мешок для мусора, 70% этанол и 2 препарирующие чашки (диаметром 3,5 см) на льду, наполненные 2 мл HBSS каждая.
3. Аккуратно держите и опрыскайте голову и шею мышиного щенка 70% этанолом. Животное приносят в жертву путем обезглавливания с помощью ножниц.
4. Выполните разрез по средней линии, сзади к переднему, вдоль кожи головы, чтобы открыть череп.
5. Аккуратно разрежьте черепную коробку от шеи до носа. Два дополнительных разреза выполняются для обеспечения дальнейшего доступа к мозгу: первый разрез делается спереди от обонятельных луковиц, другой — ниже мозжечка, чтобы отделить череп от основания черепа.
6. С помощью щипцов с плоским концом черепные лоскуты аккуратно отворачиваются в сторону, а мозг извлекается и помещается в первую препарирующую чашку, наполненную HBSS. Поставьте блюдо обратно на лед и продолжайте собирать все 4 мозга.
7. Остальная часть процедуры диссекции выполняется под стереомикроскопом. Сначала обонятельные луковицы и мозжечок удаляются с помощью тонких рассекающих щипцов (рис. 1B).
8. Чтобы извлечь кору головного мозга, захватите задний конец мозга тонкими щипцами, выполните разрез по средней линии между полушариями, вставьте второй набор щипцов в созданную рощу и отклейте пластинчатую структуру коры головного мозга.
9. Осторожно рассеките мозговые оболочки из полушарий коры головного мозга, вытягивая тонкими щипцами (Рисунок 1D'). На этом этапе можно избежать контаминации окончательной культуры астроцитов менингеальными клетками и фибробластами. Переложите подготовленные полусферы коры головного мозга во вторую чашку, наполненную HBSS, и верните ее на лед. Продолжайте соответственно со всеми 4 кортикальными мышцами.
10. Наконец, разрежьте каждое полушарие коры головного мозга на небольшие кусочки с помощью острых лезвий (примерно от 4 до 8 раз).
11. В стерильных условиях перенесите кусочки коры головного мозга в одну пробирку Falcon объемом 50 мл и добавьте HBSS в общем объеме 22,5 мл.
12. Добавьте 2,5 мл 2,5 % трипсина, перемешайте и инкубируйте ткань на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 мин. Перемешивайте путем периодического встряхивания каждые 10 минут.
13. Центрифугируйте в течение 5 минут при 300 х г для гранулирования кусочков коры головного мозга.
14. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем сцеживания. Во избежание потери тканевой гранулы ее можно механически удерживать с помощью пипетки. Диссоциируйте ткань в одноклеточную суспензию путем добавления 10 мл астроцитарной среды и энергичного пипетирования с помощью пластиковой пипетки объемом 10 мл до тех пор, пока кусочки ткани не будут диссоциированы на отдельные клетки (от 20 до 30 раз). Отрегулируйте объем до 20 мл с помощью астроцитарной среды. Доказать диссоциацию ткани коры головного мозга на отдельные клетки можно, подсчитав с помощью гематоцитометра. Один препарат из 4 коры детенышей мыши должен дать 10–15 x 10⁶ диссоциированных одиночных клеток.
15. Аспиратуйте PDL из колбы с культурой T75, поместите диссоциированную суспензию одиночных клеток и инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе с_CO2.

2. Получение обогащенной культуры астроцитов

1. Меняйте среду через 2 дня после осаждения смешанных корковых клеток и все 3 дня после этого.
2. Через 7–8 дней, когда астроциты сливаются и накладывающиеся на них микроглии обнажаются на слое астроцитов или уже отделены от слоя астроцитов (рис. 2), встряхивайте колбу T75 со скоростью 180 об/мин в течение 30 минут на орбитальном шейкере, чтобы удалить микроглию. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую микроглию, или, если вы хотите культивировать и исследовать микроглию, открутите ее вниз и подготовьте к посеву.
3. Добавьте 20 мл свежей среды для культивирования астроцитов и продолжайте встряхивать колбу при 240 об/мин в течение 6 часов для удаления клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC). Поскольку некоторые OPC не полностью отделяются от слоя астроцитов, продолжайте энергично встряхивать рукой в течение 1 минуты, чтобы предотвратить загрязнение OPC. Выбросьте надосадочную жидкость или поверните ее вниз и нанесите на тарелку, если вы хотите культивировать OPC.
4. Оставшийся сливающийся слой астроцитов дважды промойте PBS, аспирируйте PBS, добавьте 5 мл трипсина-ЭДТА и инкубируйте в инкубаторе CO₂ при температуре 37 °C. Проверяйте отрыв астроцитов каждые 5 минут и усиливайте отрыв астроцитов, ударяя колбу по ладони (2–3 раза).
5. После отделения астроцитов от колбы для культивирования добавьте 5 мл питательной среды для астроцитов, вращайте клетки при 180 х г в течение 5 мин, аспиратируйте надосадочную жидкость и добавьте 40 мл свежей среды для покрытия астроцитов. Из одной колбы с культурой тканей T75 должно получиться около 1x10⁶ клеток после первого клеточного деления. Пластинчатые клетки в двух культуральных колбах T75 и инкубируются при 37 °C в инкубаторе CO₂. Меняйте носитель каждые 2-3 дня.
6. Через 12–14 дней после первого расщепления астроциты пламируются в соответствующей концентрации клеток за 24–48 ч до проведения эксперимента. Из одной колбы с тканевой культурой Т75 должно получиться около 1,5–2^{х10 6} клеток после второго клеточного деления.

Результаты

Рисунок 1. Вскрытие постнатальной (Р3) коры головного мозга. А) Весь мозг. Б) Головной мозг после удаления обонятельных луковиц и мозжечка. В) Изоляция коры головного мозга путем отслаивания пластинчатой структуры коры головного мозга. D, D') Кора головного мозга от вентрального и дорсального участка с мозговыми оболочками (черными стрелками обозначены менингеальные артерии). Д) Кора г...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среды для культивирования астроцитов
DMEM с высоким уровнем глюкозы	Технологии Life	31966-021
FBS термоинактивированный	Технологии Life	10082-147	Конечная концентрация: 10%
Пенициллин-стрептомицин	Технологии Life	15140-122	Конечная концентрация: 1%
Решение для переваривания мозговой ткани
HBSS	Технологии Life	14170-088 (Английский)
2,5% трипсин	Технологии Life	15090-046	Конечная концентрация: 0,25%
другой
70% (об/об.) этанола	Рот	9065.2
Поли-D-лизин	Миллипор А-003	А-003-Э
Вода	ПАА	С15-012	Сорт клеточной культуры
ПБС	ПАА	Х15-002	Сорт клеточной культуры
0,05% Трипсин-ЭДТА	Технологии Life	25300-062
0,45 мкм Стерильный фильтр	Сарториус	No 16555
Чашка Петри 3,5 см	BD Falcon	353001
Туба Falcon 15 мл	BD Falcon	352096
Туба Falcon 50 мл	BD Falcon	No 352070 (Английский
75 см2 Колба для культуры тканей	BD Falcon	353136
Щипцы тонкие	Дюмон	2-1032; 2-1033	#3c; #5
Щипцы с плоским наконечником	КЛС Мартин	12-120-11
Хирургические ножницы 13 см	Эскулап	БК-140-Р
Стереомикроскоп	Лейка		МЗ7.5
Стереомикроскоп + фотоаппарат	Лейка		MZ16F; ДФК320
Микроскоп + камера	Цейсс; Канон		Primo Vert; PowerShot A650 IS
центрифуга	Эппендорф	5805000.017	центрифуга5804R
Орбитальный шейкер	Термо Сайентиал	ШКЕ 4450-1СЕ	МаксQ 4450
Водяная баня	Джулабо		SW20; 37 °C

)