Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение микрососудов мозга крысы
- Для каждого препарата и для одного экспериментатора используйте 3 пятинедельных крысы Вистар.
- В понедельник первой недели приготовьте 2 колбы T75, покрыв их коллагеном IV типа и фибронектином в концентрации 1 г/см2 в стерильной питательной воде (10 мл на T75). Дайте прилипнуть при температуре 37 °C до засева микрососудов.
- В среду утром первой недели усыпьте крыс под нарастающим потокомCO2, чтобы вызвать сонливость, потерю осанки и остановку дыхания, а затем вывих шейки матки. Опрыскайте головки 70% этанолом. Срежьте головки ножницами и переложите их в сухую чашку Петри под ламинарный вытяжной колпак.
- Удалите мозги из черепа без мозжечка и зрительных нервов, затем перенесите их в охлажденную на льду чашку Петри и заполненную буфером для холодной диссекции (HBSS с добавлением 1% BSA, пенициллина 100 единиц/мл и стрептомицина 100 μг/мл).
- Разрежьте мозг пополам, чтобы отделить 2 полушария головного мозга и отделить средний мозг от переднего. Переложите передние мозги в чистую чашку Петри на льду с буфером для рассечения.
- Возьмите пару полушарий в новую чашку Петри с буфером для холодной диссекции, чтобы аккуратно удалить мозговые оболочки из переднего мозга под стереомикроскопом с 5 изогнутыми щипцами. Затем очистите внутреннюю часть мозга, чтобы удалить одеяло из миелина и получить оболочку коры. Эти шаги не должны занимать более 2 часов для сохранения тканей и выживания клеток.
- Диссоциируйте кору головного мозга из 3 головных мозга на 6 мл буфера для холодной диссекции в гомогенизаторе объемом 7 мл на 10 движений вверх и вниз каждым из 2 пестиков с разным зазором, 71 мкм, а затем 20 мкм.
- Разделите суспензию до получения эквивалента 1 коры головного мозга на 1 мл пробирки Falcon объемом 50 мл и центрифугируйте при 1000 x g в течение 5 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Расщепляют суспензию из 1 коры с 1 мл ферментативного раствора, содержащего смесь коллагеназы/диспазы (60 мкг/мл–0,3 Ед/мл), ДНКазы I типа (35 мкг/мл–20 К ед/мл) и гентамицина (50 мкг/мл) в шейкере в течение 30 мин при 37 °С.
- Смешайте 1 мл дигеста из 1 коры с 10 мл 25 % BSA/HBSS 1X и разделите центрифугированием в зависимости от плотности при 3 600 x g в течение 15 минут при RT. Осторожно перенесите верхний диск (миелин и паренхима мозга) и надосадочную жидкость в чистую пробирку Falcon объемом 50 мл и повторите центрифугирование. Полученную гранулу, содержащую микрососуды мозга, хранить при температуре 4 °C.
- Аккуратно выбросьте верхний диск и надосадочную жидкость. Обе полученные гранулы, содержащие микрососуды головного мозга, ресуспендируют 1 мл холодного HBSS 1X и переложите в чистую пробирку Falcon объемом 50 мл.
- Промойте микрососуды добавлением 20 мл холодного HBSS 1X и центрифугируйте при 1000 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Далее расщепляют микрососуды из 1 коры с 1 мл того же ферментативного раствора, как описано на шаге 1.9, в течение 1 часа при 37 °С в шейкере.
- Затем смешайте переваренные микрососуды из каждой из 3 коры головного мозга в одну пробирку и далее разделите на две пробирки Falcon объемом 50 мл для получения микрососудов, извлеченных из эквивалента полутора (1,5) коры на пробирку. Добавьте 30 мл буфера для холодной диссекции и центрифугуйте при давлении 1 000 x g в течение 5 минут при RT.
- Ресуспендируйте гранулу микрососуда в 10 мл DMEM/F12 с добавлением 20% сыворотки плазмы, бедной тромбоцитами крупного рогатого скота, основного фактора роста фибробластов (bFGF, 2 нг/мл), гепарина (100 мкг/мл), гентамицина (50 мкг/мл) и HEPES (2,5 мМ), называемых эндотелиальными клеточными средами (ВКМ), с добавлением пуромицина в концентрации 4 мкг/мл.
- Возьмите из инкубатора 2 колбы Т75 с покрытием, отаскайте излишки покрытия и прокройте микрососуды из каждой пробирки в одной колбе Т75 (микрососуды извлечены из 1,5 коры на колбу Т75).
