Модель гематоэнцефалического барьера или BBTB: адаптация модели гематоэнцефалического барьера или BBB для оценки доставки терапевтических препаратов к опухоли

Аннотация

Источник: Le Joncour, V. et al. Прогнозирование доставки полезных нагрузок in vivo с использованием гематоэнцефалического барьера в чашке. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы описываем комплексный протокол для создания модели in vitro, имитирующей гематоэнцефалический барьер. Эта модель обещает понять доставку терапевтических агентов для лечения опухолей головного мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Создание мимики BBTB

ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для клеточных культур и добавки подробно описаны в Таблице материалов.

1. Получение астроцитов
   заметка: Следующие объемы подходят для чашки Петри диаметром 10 см или колбы для клеточных культур T75.
   1. Под стерильным колпаком для клеточных культур тщательно промойте культивируемые астроциты 5 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Аккуратно выбросьте PBS с помощью вакуумного насоса и добавьте 2 мл реагента для диссоциации клеток в течение 5 минут (при 37 °C, см. Таблицу материалов), чтобы отделить клетки. Проверьте отслойку клеток под микроскопом. Не превышайте 5 минут инкубации, чтобы ограничить нагрузку на клетки.
   2. Добавьте в сосуд 10 мл стерильной полной среды для культивирования астроцитов (ABM+) для ингибирования активности реагента для диссоциации клеток. Используйте стерильную серологическую пипетку для переноса отделенных клеток из сосуда в стерильную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте суспензию элемента в течение 3 мин при 250 rcf (ускорение: 9 rcf/s, замедление: 5 rcf/s) при комнатной температуре (RT).
   3. Тем временем подготовьте вкладыши (см. Таблицу материалов): С помощью стерильных щипцов поместите вкладыши мозговой стороной вверх (Рисунок 1А) на крышку стерильной 6-луночной пластины (Рисунок 1В). Заранее убедитесь, что пластину можно положить на вставки вверх ногами, не касаясь и не перемещая вставки во время процесса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное расположение вставок позволяет захватить суспензию астроцитов между мембраной и дном лунки.
   4. После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость из клеточной суспензии; повторно суспендируйте астроцитарную гранулу в 1 мл ABM+, осторожно ресуспендируя гранулу на стенке пробирки до 5 раз. Избегайте чрезмерного пипетирования клеток, чтобы ограничить нагрузку на клетки. Подсчитайте ячейки и отрегулируйте плотность суспензии ячеек до 1,5 x 10⁵ ячеек в 400 мкл ABM+/вставка.
   5. Поместите клеточную суспензию в середину мембраны вкладыша со стороны мозга (рис. 1B) и очень осторожно распределите ее, используя капиллярную силу с помощью стерильного наконечника пипетки. Избегайте прямого контакта, так как мембрана особенно хрупкая.
   6. Удерживая мозговую сторону вставок все еще вверху, поместите 6-луночный планшет обратно на вкладыши. Это гарантирует, что клеточная суспензия будет зажата между мембраной и фактическим дном лунки (Рисунок 1C). Избегайте попадания пузырьков воздуха в клеточную суспензию, так как это будет препятствовать однородному распространению астроцитов по мембране.
   7. Поместите планшет и вкладыши мозговой стороной вверх в инкубатор (при температуре 37 °C с 5%_CO2), чтобы обеспечить адгезию клеток в течение минимум 2 ч (астроциты мышиной иммортализации) и до 6 ч (первичные астроциты человека).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку вставки находятся в перевернутом положении, визуализация адгезии клеток под микроскопом невозможна. Поэтому рекомендуется засеивать отдельный обычный сосуд для клеточной культуры и контролировать адгезию клеток в сосуде с течением времени. Осторожные манипуляции с мембраной являются обязательными, так как результаты будут ненадежными при повреждении мембран.
   8. По окончании времени инкубации убедитесь в отсутствии утечек суспензии ячеек за пределы зоны посева и выбросьте вставки, если они негерметичны. Верните 6-луночный планшет в исходное положение со вставками, которые теперь будут располагаться кровью вверх (Рисунок 1A). Добавьте в каждую лунку по 2,6 мл ABM+. Налейте по 2,5 мл полной астроцитарной среды в каждый вкладыш и поместите планшет в инкубатор (при температуре 37 °C с 5%_CO2).

2. Получение эндотелиальных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга мыши (bEND3) клетки должны достичь 100% слияния, чтобы обеспечить максимальные межклеточные контакты, запускающие оптимальную экспрессию белка плотного соединения в день эксперимента. Это не относится к эндотелиальным клеткам пупочной вены человека (HuAR2T), поскольку присутствие астроцитов требуется для экспрессии белков в плотном соединении этих клеток.

1. Действуйте, как описано ранее, для астроцитов для диссоциации клеток. После центрифугирования осторожно выбросьте надосадочную жидкость; ресуспендировать гранулу эндотелиальных клеток в 1 мл полной среды для культивирования эндотелиальных клеток (EBM+) путем медленного пипетирования клеточной суспензии на стенке пробирки до 5 раз. Избегайте чрезмерного пипетирования клеток, чтобы ограничить нагрузку на клетки. Подсчитайте клетки и отрегулируйте плотность клеточной суспензии до 2 x 10⁵ клеток в 2,5 мл/вставка среды для культуры эндотелиальных клеток, лишенной сыворотки (EBM-) и фактора роста эндотелия сосудов-А (VEGF-A).
2. Выньте пластину со вставками, осторожно выбросьте среду со стороны крови и замените ее 2,5 мл суспензии эндотелиальных клеток. Верните планшет в инкубатор (при температуре 37 °C с 5%_CO2) и оставьте на ночь, чтобы эндотелиальные клетки прилипли к мембране.
3. На следующий день приготовьте стерильный 6-луночный планшет, переложив в каждую лунку по 3 мл предварительно подогретой бессывороточной астроцитарной среды (ABM-). Обрабатывая вкладыши стерильными щипцами, осторожно удалите эндотелиальную полную среду со стороны крови, поместите вкладыш в новую пластину, содержащую ABM-, и добавьте 2,5 мл EBM-.
   заметка: Использование EBM- имеет решающее значение для установления эндотелиального барьера.
4. Оставьте вкладыши в инкубаторе (при температуре 37 °C с 5%_CO2) с минимальными физическими нарушениями и колебаниями температуры в течение 5 дней, что позволит производить эндотелиальную базальную мембрану, контактировать астроциты с эндотелиальными клетками и, в конечном итоге, формировать имитацию BBTB. Замените среду в день переноса на клеточные культуры глиомы.

3. Подготовка клеток глиомы

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя здесь используются сферы глиобластомы, полученные от пациента, следующий протокол может быть легко адаптирован для адгезивных, коммерчески доступных клеток глиобластомы, таких как U-87MG.

1. Необязательно, для иммунофлуоресцентной визуализации помещают до четырех круглых стерильных боросиликатных покровных стекол (ø 0,9 см) на лунку в 6-луночный планшет, содержащий 2 мл поли-D-лизина (0,01%). Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.
2. Тем временем осторожно перенесите опухолевые сферы из сосуда для культивирования клеток в стерильную пробирку объемом 15 мл с помощью стерильной серологической пипетки. Центрифугируйте опухолевые сферы в течение 3 мин при 250 RCF.
3. Выбросьте надосадочную жидкость, аккуратно суспендируйте сферы в 1 мл клеточной среды глиомы без bFGF/EGF (GBM-) и подсчитайте клетки. Отрегулируйте плотность ячеек примерно до 10⁴ сфер/мл (10⁵ клеток/мл) в GBM-.
4. Выбросьте поли-D-лизин из лунок и промойте их 3 раза стерильным PBS. Засейте планшет 3 мл/лунку опухолевой сфероидной суспензии и перенесите вставки с имитатором ГЭБ на суспензию опухолевых клеток.
5. Инкубируйте в течение ночи (при 37 °C с 5%_CO2), чтобы обеспечить равновесие между кровью и опухолевыми сторонами мозга в анализе. На следующий день замените среду в крови на EBM-, дополненную молекулами/лекарствами/наночастицами, представляющими интерес. Образцы собираются с течением времени для прямого количественного анализа, как описано в предыдущем разделе. Клетки фиксируются в определенный момент времени для флуоресцентной визуализации.

Результаты

Рисунок 1: Описание модели гематоэнцефалического барьера для опухоли (BBTB).(A) Схематическое изображение расположения различных типов клеток. (B) Иллюстрация размещения вкладыша на крышке 6-луночного планшета и техника посева астроцитов на мозговой стороне мембраны вкладыша. (C) Иллюстрация размещения 6-луночного планшета, обеспечивающего адгезию астроцитов. (D) Иммуно...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетки
bEND3	АТКС	ЦРЛ-2299	Культивируется в: DMEM (1 г/л глюкозы) с добавлением 10% FBS - 5 мл L-глутамина и 5 мл пенициллина/стрептомицина
HIFko увековечил мышиные астроциты	Выделено в лаборатории доктора Габриэле Бергерс	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Культивируется в: BME-1 с добавлением 5% FBS - 5 мл 1 М HEPES-5 мл 100 мл пирувата натрия - 3 г D-глюкозы и 5 мл пенициллина/стрептомицина
ХуАР2Т	Изолировано в лаборатории доктора Дагмар Вирт	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Культивировано в: EBM-2 с SupplementMix нормальные первичные астроциты человека Lonza CC-2565 Культивировано в: ABM с SingleQuots
Материалы и реагенты
100 мм x17 мм Блюдо Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	150350 (Английский
10 мл серологической пипетки	ThermoFisher Scientific	170361
Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробирки 15 мл	ThermoFisher Scientific	No 339650 (Английский
ABM базальный средний 500 мл	Лонза	СС-3187	Для первичных астроцитов человека. ABM+: содержит все добавки из смеси добавок. ABM-: все добавки, кроме rhEGF и FBS
Раствор для отслойки клеток аккутазы	Корнинг	25-058-КИ
AGM SingleQuots Добавки и факторы роста	Лонза	СС-4123
Доплата B27	Gibco	17504-044	Как для GBM+, так и для - среднего
Базальный средний орел	ThermoFisher Scientific	21010046	БМЭ-1
Corning Costar TC-обработанные 6-луночные планшеты	Сигма-Олдрич	CLS3506
Вставки для клеточных культур Corning Transwell с полиэфирной мембраной	Сигма-Олдрич	CLS3452
D-глюкоза	Сигма-Олдрич	Г8270	Растворите в 50 мл BME-1 и стерильном фильтре перед добавлением в среду
Модифицированная Eagle's Medium/питательная ветчина F-12 от Dulbecco	Gibco	No 21331-020	Специфично для культуры сфер, полученных от пациента, выделенных в нашей лаборатории; может отличаться для других клеточных линий глиомы
EBM-2 Среда для роста SupplementMix	PromoCell	С-39216	EBM+: содержит все добавки из смеси добавок. EBM-: все добавки, кроме VEGF-A и FBS
Эндотелиальная базальная среда 2 (EBM-2)	PromoCell	С-22211	EBM+: содержит все добавки из смеси добавок. EBM-: все добавки, кроме VEGF-A и FBS
Фетальная бычья сыворотка (FBS), сертифицированная, термоинактивированная, одобренная ЕС для Южной Америки	ThermoFisher Scientific	10500056
Флуоресцеиновая натриевая соль	Сигма-Олдрич	Ф6377
Пластины Greiner CELLSTAR на 96 лунок	Сигма-Олдрич	Грейнер 655090	Черные полистирольные колодцы плоского дна (с микропрозрачным дном)
Menzel-Gläser 0,9 см круглая боросиликатная крышка	Термо Сайентиал	10313573
Таблетки PBS	Медикаго	09-9400-100 (Английский)	Одна таблетка на литр dH2O; затем стерилизуйте раствор путем автоклавирования
Гидробромид поли-D-лизина	Сигма-Олдрич	П6407
Рекомбинантная человеческая EGF	Пепротех	ГМП100-15	Для GBM+ средний
Рекомбинантный человеческий FGF-basic (154 а.а.)	Пепротех	100-18В	Для GBM+ средний

) )