Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Гомогенизация
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги выполняются при температуре 4 °C.
- Добавьте 1,5 мл трикаина (15 мМ) в чашки Петри 90 мм, содержащие 50 личинок, в 50 мл эмбриональной среды Е3, обработанной 200 мкМ ПТУ, для их смертельной анестезии.
- Отсосите 10 личинок под наркозом из чашек Петри с помощью пластиковой пипетки Пастера объемом 3 мл.
- Перенесите обезболенных личинок 10 на 10 в 55-мм чашку Петри, наполненную ледяной средой зародыша Е3 + трикаин.
- Под стереомикроскопом выровняйте 10 личинок в центре чашки Петри. Затем с помощью хирургических микроножниц пересечьте личиночные головки над желточным мешком (исключите плавательный пузырь, чтобы избежать плавающих голов).
- Отсасывайте головки из чашек Петри с помощью пластиковой пипетки Пастера объемом 3 мл. Подождите, пока все головки соберутся внутри наконечника пипетки, а затем переложите их в стеклянный гомогенизатор, содержащий 1 мл ледяной среды А (передавайте в минимальном объеме, чтобы уменьшить разведение среды А на Е3 + трикаин). Держите стеклянный гомогенизатор на льду. Используйте один гомогенизатор для каждого экспериментального условия.
- Заменяйте каждую маленькую чашку Петри, содержащую ледяной Е3 + Трикаин, на новую каждые 30 минут, чтобы убедиться, что пересечение выполняется в холодной среде Е3 + Трикаин.
- Замените ледяной фильтрующий материал А в стеклянном гомогенизаторе, когда цвет начнет тускнеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда Разведение может изменить ткани головы из-за изменений температуры.
- После того, как все напоры будут собраны (600 голов в кондиции), удалите максимальный объем среды А из стеклянного гомогенизатора и замените ее 1 мл свежей ледяной среды А.
- Нарушьте мозговую ткань с помощью плотного стеклянного гомогенизатора на льду. Выполните 40 раундов дробления и оборотов для личинок 3–5 dpf и 50 для личинок 7 и 8 dpf.
- Добавьте 2 мл среды А в клеточную суспензию (1 мл среды А/200 головок), что разбавит клетки и уменьшит их агломерацию миелином для облегчения их разделения при центрифугировании в среде с градиентом плотности.
- Чтобы устранить клеточную агломерацию, пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 мкм, помещенный поверх холодной соколиной трубки объемом 50 мл, удерживаемой на льду. Повторите эту операцию 3 раза.
- Перенесите 1 мл клеточной суспензии в холодные пробирки объемом 1,5 мл и вращайте их при 300 г в течение 10 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью шприца объемом 10 мл + игла 23G x 1''.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу с 1 мл ледяной среды с градиентом плотности 22%, аккуратно покрытой 0,5 мл ледяной DPBS 1x (не смешивайте их, будет видна интерфаза между обоими растворами).
- Вращайте трубки при 950 g без тормоза и медленном ускорении в течение 30 минут при 4 °C.
Примечание: На этом этапе миелин отделяется от других клеток путем его секвестрации в интерфазе среды с градиентом плотности DPBS 1x и 22%, в то время как клетки будут гранулироваться на дне пробирки. Удаление миелина более эффективно, когда концентрация в клетках не слишком высока.
- С помощью шприца 10 мл + иглы 23G x 1'' отбросьте максимум DPBS, градиент плотности среды и миелин, захваченный в их интерфазе.
- Промойте клетки 0,5 мл среды А + 2% нормальной сыворотки крови коз (NGS), затем открутите пробирки при 300 г в течение 10 минут при 4 °C.
- Отбросьте максимум надосадочной жидкости, затем объедините все клеточные гранулы из тех же экспериментальных условий в 1 мл среды А + 2% NGS.
- Если интересующие клетки экспрессируют флуоресцентные белки-подобные макрофаги/микроглию из mpeg1:eGFP или нейроны трансгенных рыб NBT:DsRed, пропустите клеточную суспензию через колпачок клеточного фильтра размером 35 мкм и перенесите их в холодные 5 мл пробирки FACS на льду, защищенные от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно провести иммуноокрашивание микроглии.