Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Иммуноокрашивание микроглии
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги выполняются при температуре 4 °C.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу, полученную из клеток культуры мозга, 0,3 мл среды А + 2% нормальной козьей сыворотки или NGS. Разделите их на 3 пробирки по 1,5 мл: одну для неокрашенных клеток для измерения аутофлуоресценции из представляющих интерес клеток, вторую для вторичного антитела (1/200) для измерения неспецифического связывания вторичного антитела с микроглией, а третью в качестве теста (моноклональное антитело мыши 4C4 (специфичное для микроглии) (1/20) + вторичное антитело (1/200)).
- Добавляйте Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) в концентрации 1% в клетки (все пробирки), чтобы блокировать взаимодействие CD16/CD32 с Fc-доменом иммуноглобулинов. Инкубируйте клетки в течение 10 мин с легким перемешиванием каждые 5 мин.
- Добавьте антитело 4C4 (1/20) в клетки (пробирка 3) и инкубируйте в течение 30 минут с легким перемешиванием каждые 10 минут.
- Вращайте трубки при 300 г в течение 10 минут при 4 °C, затем выбросьте надосадочную жидкость.
- Промойте один раз 0,5 мл среды A + 2% NGS, затем открутите пробирки при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C.
- Ресуспендировать клеточную гранулу 0,5 мл среды А + 2% NGS и инкубировать клетки с LEAF в концентрации 1% в течение 10 мин с легким перемешиванием каждые 5 мин.
- Добавьте вторичное антитело (1/200) в клетки (пробирки 2 и 3). Инкубируйте клетки в течение 30 минут с легким перемешиванием каждые 10 минут и защитой от света.
- Вращайте пробирки при 300 г в течение 10 минут при 4 °C, затем выбросьте надосадочную жидкость.
- Дважды промойте 0,5 мл среды A + 2% NGS, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу 1 мл среды A + 2% NGS.
- Пропустите клеточную суспензию через колпачок клеточного фильтра толщиной 35 мкм и перенесите их в холодную 5 мл флуоресцентно-активируемую сортировку клеток или пробирки FACS на льду, защищенные от света.
2. Сортировка ячеек (FACS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги при температуре 4 °C.
- Сортируйте нейроны, макрофаги/микроглии и микроглии с помощью FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обычно выполняется сотрудником объекта FACS, а настройки зависят от типа используемого оборудования.
- Добавьте DAPI в концентрации 1 г/мл в каждую пробирку FACS для мечения мертвых клеток.
- Настройте FACS и отсортируйте нейроны, макрофаги/микроглии или микроглии из всех клеток мозга. Отделите ячейки от мусора в зависимости от их размера и зернистости, затем затворите одиночные ячейки с помощью прямого и бокового рассеяния. Исключение мертвых клеток с помощью DAPI-мечения из живых клеток. Идентифицируйте нейроны, макрофаги/микроглии или микроглии по их соответствующему положительному окрашиванию.
- Соберите клетки в пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 1 мл ледяной среды А + 2% NGS на льду. Используйте разные пробирки для каждого типа клеток.
- Вращайте пробирки при температуре 300 x g в течение 10 минут при 4 °C, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
- Промойте один раз 0,5 мл среды А, затем выбросьте максимум надосадочной жидкости.
