Нокдаун гена, опосредованный короткой шпилькой в iHSPCs in vitro: доставка системы экспрессии shRNA на основе лентивируса в iHSPCs для подавления экспрессии специфических генов

Аннотация

Источник: Hsiao, Y. L., et al. Исследование развития дендритных клеток путем нокдауна гена, опосредованного короткой РНК-шпилькой, в линии гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео мы демонстрируем метод выполнения трансдукции лентивирусных векторов shRNA для получения стабильных нокдаун-клеточных линий в иммортализированных гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках (iHSPCs).

Протокол

1. Получение иммортализованных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеточных линий (iHSPCs)

1. Поддерживайте клеточную линию iHSPC в полной среде RPMI 1640, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола.
2. Пропускайте клетки в соотношении 1:10 каждые 3 дня.<бр/> заметка: Приготовьте полную среду RPMI 1640, добавив 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 5 x ^10-5 М β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина. Рекомбинантный мышиный FL также коммерчески доступен.

2. Лентивирусная трансдукция

1. Планшеты iHSPC с плотностью 1 x 10⁵ клеток/лунку в 12-луночных планшетах в 1 мл полной среды, содержащей 100 нг/мл FL, 1 мкМ β-эстрадиола и 8 мкг/мл полибрена.
   заметка: Концентрация полибрена зависит от типа клеток и обычно находится в пределах 4-8 мкг/мл.
2. Добавьте в каждую лунку лентивирус, несущий shRNA, при кратности инфекции (MOI) 100,
   заметка: Лентивирусным вектором является pLKO.1-Puro с маркером выбора пуромицина (рис. 1). Последовательности-мишени шРНК против LacZ, Tcf4 и Id2 соответственно перечислены в таблице материалов. MOI определяется количеством вирионов, которые добавляются на клетку во время инфекции.
   
3. Вращайте пластины при температуре 1 100 x g в течение 90 минут при температуре 37 °C.
4. Инкубируйте планшет с инфицированными клетками в течение ночи при температуре 37 °C в инкубаторе.
   заметка: Если клетки чувствительны к полибрену, то после спиновой инфекции обновите клетки полной средой без полибрена.
5. Обновите клетки полной средой, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола, через 24 ч после инфекции.
6. Добавьте 6 мкг/мл пуромицина в среду для отбора инфицированных клеток после дополнительных 24 г.<бр/> заметка: Трансдуцированный лентивирусный вектор обычно экспрессирует гены, в том числе гены, устойчивые к пуромицину. Убедитесь, что концентрация пуромицина оптимизирована для каждой клеточной линии.
7. Обновляйте отборную среду, содержащую 100 нг/мл FL, 1 мкМ β-эстрадиола и 6 мкг/мл пуромицина, каждые 3 дня и поддерживайте клетки в течение не менее одной недели для расширения стабильно трансдуцируемых клеток iHSPC><. заметка: Отбор пуромицина обычно вступает в силу через 48 ч, а период отбора зависит от типа клеток.

Результаты

Рисунок 1: Конструкция лентивирусного вектора pLKO.1-Puro.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 мл Микропробирка	ЭкстраГен	ТРУБКА-170-С
12-луночный планшет, обработанный тканевой культурой	сокол	353043
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Корнинг	35-010-СВ
RPMI 1640 средний	Gibco	11875-085 (Английский)
β-эстрадиол	Сигма-Олдрич	Э2758-250МГ
β-меркаптоэтанол (β-ME)	Сигма-Олдрич	М6250
Лиганд Flt3 (FL)	домашний
Полибрен	Сигма-Олдрич	ТР-1003-Г
Пуромицин	Инвивоген	АНТ-ПР-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	Консорциум РНК-интерференции (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	Консорциум РНК-интерференции (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	Консорциум РНК-интерференции (TRC)